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  近年來，癌癥疫苗作為免疫治療的一種形式，相比手術、放療和化療等傳統治療方式具有獨特優勢。它通過誘導腫瘤特異性免疫反應產生長期記憶效應，可防止腫瘤復發、減輕患者痛苦、提高生存率。然而，眾多正在開展的癌癥疫苗臨床研究仍不盡如人意，主要受制于抗原交叉呈遞效率低下、腫瘤微環境（TME）免疫抑制等挑戰。納米疫苗已成為解決這一問題的有效途徑。

  開發有效的納米疫苗，關鍵在于在特定納米載體中結合抗原與佐劑。腫瘤源性外泌體（Exos）作為內源性囊泡，不僅天然攜帶多種腫瘤相關抗原（TAAs），還具有良好的生物相容性。已有研究表明一些癌細胞分泌的Exos可作為構建廣譜腫瘤疫苗的理想抗原。此外，Exos具備同源腫瘤靶向特異性，能直接與腫瘤細胞膜融合，在先進給藥系統開發中應用前景廣闊。因此基于Exos的疫苗設計在癌癥免疫治療中極具潛力。

  在免疫治療中有效激活T細胞，需通過將抗原/佐劑直接遞送至樹突細胞（DCs），或借助癌細胞的免疫原性細胞死亡（ICD）促進DCs成熟。腫瘤相關巨噬細胞（TAMs）是TME中最豐富的免疫細胞，多表現為M2表型，在免疫抑制和腫瘤進展中發揮促進作用；且TAMs溶酶體的酸性環境常導致疫苗遞送的TAAs過度降解，阻礙其有效激活DCs等抗原呈遞細胞以啟動抗腫瘤免疫應答。因此，通過復極化調節TAMs為抗腫瘤M1表型，或誘導TAMs溶酶體功能障礙，進而增強與癌細胞或DCs的相互作用、提升抗腫瘤免疫應答，具有重要意義。但目前鮮有研究關注癌癥納米疫苗的雙重或多重靶點，這類靶點需同時解決抗原交叉呈遞低效、TME免疫抑制及無法同步重編程多種細胞類型的問題。

  近年來，樹狀大分子納米凝膠（DNGs）受到廣泛關注，它結合了樹狀大分子與納米凝膠的特點和優勢，具有良好的水分散性、流動性，易于表面修飾，可摻入造影劑（如Au NPs）和藥物，能提高癌細胞吞噬能力、增強腫瘤細胞滲透性和滯留效應。此外，通過設計不同交聯劑可制備響應TME的DNGs，實現藥物按需釋放。這些特性使DNGs成為開發多功能納米疫苗的理想平臺，既能解決抗原交叉呈遞低效、TME免疫抑制及無法同步重編程多種細胞類型的挑戰，還可通過結合造影劑實現腫瘤成像。

  本研究開發了一種外泌體偽裝的DNGs納米疫苗：以豐加霉素（Toy）偶聯的第3代聚酰胺-胺樹狀大分子為單體，FBA-PEG-FBA為交聯劑，通過反相微乳液技術制備DNGs，原位負載金納米粒子（Au NPs），物理負載免疫佐劑CpG，最后包被癌細胞來源的Exos，得到Au-DNGs/CpG@Exo（圖1A）。該納米疫苗在模擬TME環境中可快速釋放Toy，實現Exos介導的腫瘤靶向、Toy化療介導的ICD以及ICD、CpG和Exo協同促進的三重DCs成熟；同時通過Au NPs介導的TAM M1復極化和溶酶體功能障礙誘導增強免疫調節作用，整合多種免疫調節機制有助于重塑免疫抑制微環境，達成最佳抗腫瘤效果（圖1B）。

  2026年2月15日，相關研究成果以“Biomimetic Exosome-Camouflaged pH-Responsive Dendrimer Nanogels as a Therapeutic Vaccine against Pancreatic Cancer through Reprogramming of Multiple Cell Types”為題，在線發表于國際著名期刊Advanced Functional Materials (DOI: 10.1002/adfm.202420825)。東華大學生物與醫學工程學院沈明武研究員/史向陽教授為共同通訊作者，博士研究生李燕瑩為第一作者。該工作得到了國家自然科學基金委和上海市科學技術委員會等項目的資助。

圖1.仿生Exo-DNG疫苗（Au-DNGs/CpG@Exo）的制備（A）及抗腫瘤機制（B）。

  透射電鏡（TEM）與原子力顯微鏡（AFM）結果表明DNGs呈均勻球形（圖 2A-C）。TEM與SEM圖像顯示負載納米金的Au-DNGs也為均勻分散的球形結構（圖2D-E）。Exo呈現典型杯狀或碟狀形態，納米顆粒跟蹤分析（NTA）測得其粒徑主要分布于100–200 nm之間（圖2F）。WB分析（圖2H）與激光共聚焦顯微鏡（CLSM）圖像（圖2G）顯示，Au-DNGs/CpG@Exo高表達外泌體標志性蛋白TSG101與CD81，且紅綠熒光共定位，證實Exo成功包覆于Au-DNGs/CpG表面。不同pH條件下水合粒徑變化及藥物釋放結果表明Au-DNGs/CpG@Exo具有pH響應性（圖2I-J）。Au-DNGs/CpG@Exo的CT成像強度與CT值隨Au濃度升高而增加，顯示其在腫瘤CT成像中具備良好潛力（圖2K）。

圖2. DNGs的TEM圖像（A）、AFM圖像（B）和相應的AFM高度（C）。Au-DNGs的TEM圖像（D）和SEM圖像（E）。（F）Panc-02細胞源性Exos的NTA結果和TEM圖像。（G）Cy3-CpG@PKH67-Exo的CLSM圖像。（H）Panc-02細胞、Exos和Au-DNGs/CpG@Exo中TSG101和CD81蛋白的表達情況。（I）不同pH值下Au-DNGs/CpG@Exo的水動力粒徑分布圖和（J）Toy釋放曲線。（K）不同Au濃度下Au-DNGs/CpG@Exo的體外CT成像和HU值隨Au濃度的線性擬合。

  通過體外癌細胞實驗驗證發現，在相同Toy濃度下，Au-DNGs/CpG@Exo在所有材料中抗癌活性最強（圖3A）。PKH67綠色熒光與Cy3紅色熒光共定位呈明顯橙色，表明Au-DNGs/CpG@Exo在細胞攝取3小時后仍保持結構完整（圖3B）。Au-DNGs/CpG@Exo的攝取主要通過脂質筏/囊泡依賴及網格蛋白介導的內吞作用實現（圖3C-D）。CLSM與流式細胞術分析顯示，Au-DNGs/CpG@Exo可顯著提升Panc-02細胞吞噬效率，表明Exo賦予其同源癌細胞靶向特異性（圖3E-I）。

圖3.（A）不同配方處理24小時后Panc-02細胞活力測定。（B）Au-DNGs/CpG@Exo處理3小時后Panc-02細胞CLSM圖像。Panc-02細胞用不同的內吞抑制劑預處理2小時后與Au-DNGs/CpG@Exo孵育4小時后的流式細胞術分析（C）和熒光定量（D）。（E）Panc-02細胞與L929細胞分別用PBS、游離CpG、Au-DNGs/CpG和Au-DNGs/CpG@Exo處理4小時的CLSM圖像以及Panc-02（F-G）和L929細胞（H-I）經不同材料孵育4小時后的流式細胞術分析和細胞吞噬定量。

  進一步的體外實驗發現，Au-DNGs/CpG@Exo可使巨噬細胞溶酶體堿化（綠色熒光強度降低），引發溶酶體功能障礙（圖4A-C）。流式細胞術（圖4D）及M1/M2定量分析（圖4E）表明，Au-DNGs/CpG@Exo可促使M2型TAMs復極化為M1型，且CpG遞送可與Au NPs協同增強該極化作用。Au-DNGs/CpG@Exo可直接促進DCs成熟，并上調其表面MHC-I與MHC-II分子表達（圖4F-J）。

圖4. 不同材料處理48小時后，經LysoSensor Green DND-189染色的RAW264.7細胞的CLSM圖像（A）、流式細胞術分析（B）和平均熒光定量（C）。IL-4誘導的RAW264.7細胞經不同制劑處理24小時后的流式細胞術分析（D）及巨噬細胞M1/M2比值定量（E）。經不同制劑處理24小時的DCs細胞流式細胞術分析（F）和成熟水平（G）。不同材料處理DCs 24小時后MHC-I（H）和MHC-II（I-J）表達的流式細胞術分析和熒光定量分析。

  團隊下一步構建Panc-02小鼠皮下瘤模型，考察Au-DNGs/CpG@Exo的體內抑瘤效果與免疫激活能力。治療期間，各治療組小鼠體重無明顯變化，表明所有材料的毒性都可以忽略不計（圖5B）。與其他組相比，Au-DNGs/CpG@Exo組腫瘤體積與重量均最�。▓D5C-E）。腫瘤組織切片染色顯示，Au-DNGs/CpG@Exo組出現大面積壞死、大量細胞凋亡及微弱細胞增殖（圖5F-H）。免疫熒光染色結果顯示，Au-DNGs/CpG@Exo組腫瘤組織CRT暴露與iNOS水平顯著升高，Arg-1水平明顯降低（圖5I-K），證實其可有效抑制胰腺癌生長并產生ICD。

圖5. （A）腫瘤模型建立及納米疫苗治療效果分析示意圖。荷瘤小鼠在治療期間的體重變化（B）和腫瘤體積變化曲線（C）。治療后14天各組腫瘤重量（D）和小鼠腫瘤圖像（E）。經不同材料處理14天后腫瘤切片的（F）H&E、（G）TUNEL、（H）Ki67、（I）CRT、（J）iNOS和（K）Arg-1染色。

  進一步采用流式細胞術探究Au-DNGs/CpG@Exo的體內免疫激活效應。Au-DNGs/CpG@Exo可顯著提升脾臟中CD4⁺T細胞、CD8⁺T細胞、中央記憶T細胞（T_CM）及效應記憶T細胞（T_EM）比例（圖6A-B）。該復合物可顯著提高腫瘤組織中CD8⁺T細胞、CD4⁺T細胞比例，同時降低調節性T細胞（Tregs）比例（圖6C-E）。免疫熒光染色結果顯示，與PBS組相比，各處理組腫瘤組織中CD4⁺和CD8⁺T細胞浸潤均增加，其中Au-DNGs/CpG@Exo組熒光信號最強（圖6F-G），與流式結果一致。上述結果表明，Au-DNGs/CpG@Exo可有效增強機體抗腫瘤免疫應答。

圖6. 經不同處理后的小鼠脾臟CD4⁺和CD8⁺ T細胞（A）、CD8⁺CD44⁺CD62L⁺ T_CM細胞和CD8⁺CD44⁺CD62L^- T_EM細胞（B）的代表性流式細胞術圖。不同處理后小鼠腫瘤中CD3⁺CD8⁺ T細胞（C）、CD3⁺CD4⁺ T細胞（D）和CD4⁺Foxp3⁺CD25⁺ Tregs（E）的代表性流式細胞術圖。不同處理后腫瘤組織中CD4⁺ T細胞（F）和CD8⁺ T細胞（G）浸潤的代表性免疫熒光圖像。

  團隊隨后分析Au-DNGs/CpG@Exo對胰腺癌的預防效果。4次疫苗免疫后，小鼠脾臟中CD4⁺T細胞、CD8⁺T細胞、T_CM及T_EM比例顯著升高（圖7B-C）。免疫后小鼠接種腫瘤，Au-DNGs/CpG@Exo組腫瘤體積與重量最小、小鼠生存期最長。接種腫瘤20天后，該組腫瘤組織中CD4⁺T細胞、CD8⁺T細胞比例顯著升高，Tregs比例明顯降低（圖7H-J）。上述結果表明，Au-DNGs/CpG@Exo可有效誘導長期免疫記憶效應，并抑制胰腺癌復發。

圖7. 納米疫苗預防胰腺癌的效果分析。（A）小鼠疫苗免疫后接種癌細胞預防腫瘤復發的過程示意圖。不同組小鼠接種4次疫苗后脾臟中CD8⁺和CD4⁺ T細胞（B）、CD8⁺CD44⁺CD62L⁺ T_CM細胞和CD8⁺CD44⁺CD62L^- T_EM細胞（C）的代表性流式細胞術分析。不同疫苗接種小鼠的腫瘤生長曲線（D）和腫瘤重量（E）。（F）不同治療后的腫瘤照片。（G）4次疫苗免疫后小鼠的存活率。小鼠接種皮下腫瘤20天后腫瘤中CD3⁺CD4⁺ T細胞（H）、CD3⁺CD8⁺ T細胞（I）和CD4⁺Foxp3⁺CD25⁺ Tregs（J）的代表性流式細胞術圖。

  總的來說，該研究設計的Exo仿生DNGs納米疫苗具有多個優勢：（1）DNGs的pH響應性可實現藥物在酸性腫瘤微環境中的精準釋放；（2）腫瘤源性Exos賦予納米疫苗大量抗原和同源腫瘤靶向功能；（3）化療誘導的ICD，結合納米疫苗成分CpG和Exos攜帶的TAA可增強免疫激活；（4）Au NPs通過誘導TAMs中溶酶體功能障礙和重塑免疫抑制微環境來提高抗原遞呈效率，并因其優異的X-射線衰減性能而使CT成像引導治療成為可能。該Exo基DNG納米疫苗可重編程腫瘤細胞、腫瘤相關巨噬細胞及樹突狀細胞，實現腫瘤殺傷、高效抗原呈遞并逆轉免疫抑制性TME。

  文章鏈接：https://doi.org/10.1002/adfm.202526444