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  近年來，負(fù)載干細(xì)胞的3D支架作為組織工程構(gòu)建物為代替和修復(fù)受損組織（如皮膚、骨/軟骨、脊髓等）提供了一種極具前景的解決方案。該組織工程構(gòu)建物的廣泛應(yīng)用依賴于干細(xì)胞的高效低溫保存，但其仍面臨以下挑戰(zhàn)：1）干細(xì)胞在低溫保存時(shí)，需使用有毒冷凍保護(hù)劑（如DMSO）以抑制冰晶損傷；2）解凍復(fù)蘇后，需要進(jìn)行復(fù)雜的洗脫步驟以去除這些有毒保護(hù)劑；3）解凍后的干細(xì)胞通常需要整合至3D支架中以便后續(xù)的組織工程應(yīng)用。因此，開發(fā)一種基于3D支架的干細(xì)胞低溫保存平臺(tái)，并消除有毒冷凍保護(hù)劑的使用，提供“現(xiàn)貨型”組織工程構(gòu)建物變得越來越重要。

  近日，鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院睢曉潔副教授提出了一種新型的干細(xì)胞低溫保存平臺(tái)。該平臺(tái)通過聯(lián)合聚乙烯吡咯烷酮/結(jié)冷膠/明膠（PGG）抗凍支架包封策略和L-脯氨酸誘導(dǎo)的細(xì)胞預(yù)脫水策略，實(shí)現(xiàn)了干細(xì)胞的高效低溫保存（復(fù)蘇存活率達(dá)95%），且避免了傳統(tǒng)有毒冷凍保護(hù)劑（如DMSO）的使用。在解凍復(fù)蘇后，包封小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）的PGG抗凍支架可作為組織工程構(gòu)建物（BMSCs@PGG）直接應(yīng)用于小鼠皮膚急性損傷修復(fù)，促進(jìn)傷口愈合，為實(shí)現(xiàn)干細(xì)胞的高效保存和便捷應(yīng)用提供了新思路。

圖1. 便捷用于傷口修復(fù)的干細(xì)胞低溫保存平臺(tái)示意圖

1. PGG抗凍支架的制備與表征

圖2. PGG抗凍支架的制備與表征

圖3. PGG支架抗凍性能的表征

2. L-脯氨酸誘導(dǎo)細(xì)胞預(yù)脫水

圖4. L-脯氨酸誘導(dǎo)的細(xì)胞預(yù)脫水

3. 低溫保存平臺(tái)的構(gòu)建

圖5. 低溫保存平臺(tái)的構(gòu)建

4. 生物相容性測試

圖6. 生物相容性測試

5. 解凍后干細(xì)胞的體外功能評(píng)估

圖7. 解凍后干細(xì)胞體外功能的評(píng)估

6. 解凍后的BMSCs@PGG作為組織工程構(gòu)建物用于傷口修復(fù)

  進(jìn)一步地，作者構(gòu)建了小鼠皮膚急性損傷模型，以評(píng)估解凍后BMSCs@PGG_4:1作為組織工程構(gòu)建物在皮膚再生中的應(yīng)用效果（圖8A）。如圖8B,C所示，新鮮BMSCs@PGG_4:1組和凍存BMSCs@PGG_4:1組傷口愈合速度與空白對(duì)照組相比明顯加快。治療后第14天，皮膚H&E染色圖像顯示，新鮮BMSCs@PGG_4:1組和凍存BMSCs@PGG_4:1組炎癥細(xì)胞浸潤減少，成纖維細(xì)胞增加，并伴有傷口區(qū)域新血管結(jié)構(gòu)的形成（圖8D）。此外，相比于空白對(duì)照組和新鮮BMSCs組，新鮮BMSCs@PGG_4:1組和凍存BMSCs@PGG_4:1組第14天的新生皮膚具有較薄的表皮（圖8F）、較少肉芽組織（圖8G）、更完整的真皮（圖8H）以及更多的膠原沉積（圖8E,I）。

圖9. 第14天創(chuàng)面皮膚組織的免疫熒光染色。

  綜上，作者構(gòu)建了一種新的BMSCs低溫保存平臺(tái)，該平臺(tái)通過使用PGG抗凍支架以抑制細(xì)胞外冰晶的形成，并聯(lián)合L-Pro誘導(dǎo)的細(xì)胞脫水策略以最大程度的減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，最終實(shí)現(xiàn)了干細(xì)胞的高效低溫保存，且摒棄了傳統(tǒng)有毒保護(hù)劑的使用。由于PGG支架的優(yōu)異生物相容性和獨(dú)特的3D結(jié)構(gòu)，解凍后的BMSCs@PGG不用進(jìn)行任何洗滌過程，可以直接作為組織工程構(gòu)建物用于治療小鼠皮膚急性損傷。

  原文鏈接：https://doi.org/10.1002/adhm.202404228