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北化呂永琴教授等 AHM:基于固相印跡篩選合成用于腦利鈉肽選擇性識別和檢測的分子印跡納米顆粒
2023-02-25  來源:高分子科技

  心力衰竭(HF)是一種臨床綜合征,HF患者在確診后一年和五年內死亡率分別約為20%53%。約17%-45%HF住院患者在入院一年內死亡,只有不到一半的患者能夠存活五年以上。因此,早期診斷對于HF疾病的早期治療至關重要。腦利鈉肽或B型利鈉肽(BNP)是一種心臟神經激素,是通過監測心衰治療和預防心源性急性呼吸困難的發生來診斷心衰的最重要的心臟生物標志物之一。健康個體血液中BNP 濃度極低,約為20 pg mL?1,重度充血性心衰患者濃度升至約2 ng mL?1目前已開發的用于BNP檢測的方法很多,然而,由于早期心衰患者血液中BNP含量很低,同時在體內的半衰期很短(約22 min,目前大多數檢測方法不能滿足快速、準確的要求。因此,開發一種快速、可靠、高靈敏度和高準確度BNP檢測方法具有重要的研究意義。


  抗體RNA/DNA適配體等親和試劑由于具有特定的親和力和選擇性而被廣泛用于BNP檢測,然而這些生物分子存在價格昂貴、不穩定、易失活等局限性,從而限制其臨床應用。分子印跡聚合物(MIP),通常稱為塑料抗體,具有制備簡單成本低、穩定性高等優點,是生物親和試劑經濟高效的替代品。


  為了合成對特定目標物具有高親和力和選擇性的MIP,最佳單體配方選擇至關重要。目前,研究者已開發出基于HPLC、流動注射分析或酶聯免疫吸附等方法實現最佳配方的快速篩選。盡管取得了良好的效果,但合成的MIP顆粒的印跡位點具有類似于生物多克隆抗體的異質性。


  近日,北京化工大學呂永琴教授等人在Advanced Healthcare Materials上發表了基于固相印跡法篩選合成可選擇性靶向B型利鈉肽(BNP的分子印跡納米顆粒的新方法。如圖1所示,作者使用磁性固相模板,基于固相印跡法篩選合成出含有均勻印跡結合位點的分子印跡聚合物納米顆粒(nanoMIP)。通過在nanoMIP合成中引入熒光單體熒光素丙烯酰胺(FAM)以實現納米顆粒的熒光示蹤,進而評估不同配方合成的nanoMIPBNP結合性能,最終篩選出nanoMIP的最佳合成配方。將熒光碳量子點(CD包裹MIP納米顆粒中,可以快速靈敏和準確地測定血液樣本中BNP的含量。本研究提供了一個很有前景的診斷平臺,基于固相印跡方法篩選合成MIP納米顆粒,實現復雜生物樣品中生物標志物特異性識別和快速檢測。 


1. aBNP氨基酸序列結構;b)通過將表位多肽固定在SMCC功能化的磁性納米顆粒上制備磁性模板的過程示意圖;c)熒光FAM-MIP納米顆粒的合成過程;dMIP納米包裹碳量子點的合成過程;e)熒光法檢測血清樣品中的BNP


  固相多肽模板的合成過程如圖1b所示,首先合成Fe3O4磁性顆粒,然后磁性顆粒表面覆二氧化硅殼,進一步修飾氨基,通過表面氨基SMCC反應,引入馬來酰亞胺基團來結合模板肽。如圖2所示,通過SEM、TEMDLS、FTIR、XRDZeta電位等多種表征手段證明了磁性模板的成功合成。 


2. amagNPbmagNP@SiO2和(c)磁性模板(magNP-P)的SEM;dmagNP@SiO2 TEM;magNP,magNP@SiO2magNP@SiO2-NH2magNP-P的(e粒徑分布、(fFTIR光譜、(gXRD圖譜、(hXPS元素分析、(iZeta電位和(jVSM曲線。


  圖1c闡明了基于磁性模板的固相印跡法篩選、合成和純化熒光納米MIP的原理。為了制備具有高親和力的nanoMIP,構建了功能單體組合化學文庫。將基于不同配方合成的熒光nanoMIP與磁性模板在96孔板中孵育,磁性分離后再與游離的多肽或蛋白質孵育,則游離的多肽或蛋白質會與磁性固相模板競爭與熒光納米顆粒結合。磁分離測定殘余分散液的熒光強度,其強度的高低反映了不同nanoMIP對多肽和蛋白質的親和力;诠滔嘤≯E篩選方法,最終確定最佳單體配方是10% AAc35% TBAm53% NIPAm。由圖3可以看出,基于最佳配方合成的nanoMIP對于目標多肽以及目標BNP具有良好的特異性和選擇性。 


3. a-c)通過使用磁性模板和熒光FAM單體的競爭熒光分析對MIP合成配方進行組合篩選;d-e納米顆粒對干擾肽、BNP和干擾蛋白(HSA、BSA、Mb、OVABHb)的結合特異性。


  基于最佳單體配方合成的nanoMIP的表征結果如圖4所示。BLI測試結果表明,所得nanoMIPBNP表現出高親和力和選擇性,平衡解離常數(KD10?11 M,可在7分鐘內實現BNP快速檢測,檢測線性范圍為0.255000 pg mL?1,檢測限為0.208 pg mL?1。為證明其在臨床診斷中的實用性,作者160例真實血清樣本進行了檢測分析,如圖5所示,與醫院常規使用的電化學發光檢測方法相比,該檢測方法的相對標準偏差0.08%-4.43%,相對誤差-5%-4.98%,相關系數為0.994。 


4.a-d納米顆粒的SEMTEM圖;e粒徑分布;fZeta電位gFTIR光譜;hXPS元素分析i)奈奎斯特圖。 


5. 真實血清樣本的檢測結果


  與已報道的檢測方法相比,該方法的創新性和優點包括:1)開發了一種基于固相印跡方法篩選合成含有均勻印跡位點的分子印跡人工抗體的新方法;2)利用低成本﹑高穩定性的分子印跡人工抗體替代價格昂貴﹑易失活﹑不穩定的蛋白質抗體;3)開發了一種可快速﹑準確檢測BNP的新方法,該方法可在7分鐘內完成對血清樣品中低濃度BNP的快速檢測,檢測方法具有高靈敏度和準確性。


  相關論文發表在Advanced Healthcare Materials上,北京化工大學研究生張子楹和中日友好醫院檢驗科副主任為共同第一作者,呂永琴教授為通訊作者。


  原文鏈接:https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adhm.202300146


通訊作者簡介


呂永琴,北京化工大學生命科學與技術學院教授,博士生導師,國家優秀青年基金獲得者,北京市生物加工過程重點實驗室副主任。主要在生物化工領域從事以下三個研究方向:(1) 限域微環境調控生物酶催化;(2) /電驅動生物催化;(3) 仿生抗體工程及疾病診療。相關研究成果發表論文70余篇,申請發明專利二十余項。先后主持了國家、省部級及企業合作項目十余項。獲侯德榜化工科學技術獎青年獎、教育部自然科學獎二等獎、石油化工聯合會技術發明獎一等獎等獎項。

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(責任編輯:xu)
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