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華東師范大學張強研究員課題組《ACS Nano》：一種表面功能化的多色纖維素納米球用于多重側流層析檢測

2025-01-27 來源：高分子科技

側流層析檢測（Lateral flow assay, LFA）是使用最廣泛的檢測技術之一，其可以簡單、快速、低價的檢測各種樣品中的待檢物。多重側流層析檢測（Multiplex LFAs, mLFA）可以同時檢測多種待檢物，從而可以提高檢測效率、降低檢測的成本和時間，或提高檢測的精準度。因此，mLFA可應用于諸如病毒感染、性傳播疾病、農藥污染和環境污染等需要檢測多種待檢物的檢測領域。目前應用較多的mLFA免疫探針為膠體金或聚苯乙烯微球，雖然它們做到對多種靶標的多重檢測，但存在多重可視化差、檢測靈敏度低、樣品制備要求嚴格等問題，主要原因是缺乏先進的探針。因此，迫切需要開發新的探針和相應的mLFA檢測策略。

近日，華東師范大學張強課題組聯合海軍軍醫大學第二附屬醫院（上海長征醫院）王國棟課題組以及中國農業科學院上海獸醫研究所李濤課題成功開發了一種具有高穩定性和易于表面修飾的彩色纖維素納米顆粒，并用于多重側流層析檢測。

相關工作近日以“Colored Cellulose Nanoparticles with High Stability and Easily Modified Surface for Accurate and Sensitive Multiplex Lateral Flow Assay”為題在《ACS Nano》上發表研究論文。mLFAs可以同時檢測多種分析物，具有提高檢測效率，降低成本和時間，提高分析精度等優勢。然而，探針顆粒的顏色單一、不同樣品之間的干擾以及非特異性和低靈敏度等劣勢嚴重阻礙了mLFA的廣泛應用。該研究制備了一種具有可調節顏色的聚多巴胺包裹的染色纖維素納米顆粒（dCNPs@P）探針。首先合成了尺寸可調的球形纖維素納米顆粒，然后通過成熟的工業染色方法將染料分子負載在纖維素納米顆粒表面，再包裹一層可以與抗體結合的聚多巴胺涂層。dCNPs@P顯示出比金納米粒子更高的顯色強度，還具有更高的耐鹽和抗極端pH值的穩定性。基于dCNPs@P的mLFA法成功地用于檢測谷物中的多種真菌毒素，和兩種炎癥生物標志物的感染區分。該研究為mLFA的探針材料制備提供了新的思路和方法。

該研究開發了一種制備彩色免疫探針的方法（圖1a）。首先使用簡便的方法來大規模、高質量地制備纖維素納米顆粒（Cellulose nanoparticles, CNPs）（圖1b），然后參照工業較為成熟的印染技術，將多種活性染料共價連接到CNPs的表面（dyed CNPs, dCNPs）（圖1c和d），最后將其表面包裹一層聚多巴胺涂層使其可以與生物受體相結合（polydopamine-coated dCNPs, dCNPs@P）（圖1a）。該免疫探針可以在試紙條上通過免疫反應顯現不同顏色的條帶（圖1e），并且可以在兩分鐘內同時的對三種待檢物進行定性分析（圖1f）。根據顯色區域的SEM圖片可以觀察到dCNPs@P納米顆粒被吸附在了包被相應抗體的醋酸纖維素的表面（圖1g）。

圖1. 彩色dCNPs@P探針用于LFA。

CNPs制備及表征。以再生纖維素納米纖維為原料經酶解和高壓均質處理得到CNPs（圖2a）。再生纖維素納米纖維（圖2b）經酶解后得到再生纖維素納米棒（圖2c），再通過高壓均質處理得到直徑約100 nm的CNPs（圖2d和e）。XRD顯示再生纖維素材料均為Ⅱ型纖維素（圖2f），經過纖維素酶處理過后纖維素的結晶度明顯上升，說明酶解區域主要為非結晶區（圖2g）。

圖2. CNPs的合成與表征。

dCNPs@P制備及表征。TEM圖像顯示相較于CNP（圖3a），dCNP在染色后顏色加深（圖2b），并在包裹PDA后表面覆蓋了一層約20 nm的涂層（圖2c）。dCNP在504 nm處有明顯的紫外吸收峰，在相同顆粒含量的情況下dCNPs@P的吸收峰紅移且強度變高（圖2d）。紅外光譜顯示CNP含有羧基及羥基基團，在染色和包裹PDA后具有染料與PDA相應的特征峰（圖2e）。dCNP以及dCNPs@P在XPS光譜中展示了染料與PDA特有的N元素（圖2f和g）。水合粒徑及Zeta電位也展示了CNP、dCNP以及dCNPs@P的膠體穩定性。各項表征證明了染料與PDA成功負載在了CNP的表面。

圖3. dCNPs@P的制備與表征。

探針抗體偶聯和穩定性。相較于傳統的靜電法與EDC法偶聯抗體，PDA涂層提供了邁克爾加成和席夫堿反應兩種偶聯方式，可使dCNP@P以更簡單、高效的方法連接抗體（圖4a）。該連接方式擁有更高的抗體連接效率（圖4b）。同時PDA的高穩定性使得dCNP@P相較于AuNP擁有優秀的耐鹽及抗極端pH能力（圖c和d）。更高的抗體偶聯率、更深的顏色與更大的顆粒體積使得dCNP@P在試紙條上擁有更高的顯色強度（圖e）。

圖4. dCNPs@P的抗體偶聯和穩定性。

mLFA檢測應用。使用競爭法和夾心法LFA來驗證dCNP@P作為免疫探針的效果（圖5a和f）。dCNP@P法在競爭法檢測毒素DON時展現出了優秀的特異性（圖5b），并在1-5 ng/mL的區間有著良好的線性關系（圖5c）。在同時檢測多種毒素的情況依然能保持良好的線性區間（圖5d）。在毒素隨機組合樣品的多重檢測中，展示出了比單一色系的膠體金更優秀的可視化展示效果（圖5e）。在夾心法LFA中，同時檢測CRP與SAA兩種炎癥指標可用于鑒定患者的感染類型（圖5g）。與膠體金法相比，dCNP@P檢測擁有更高的檢測靈敏度。同時由于PDA涂層的存在，使其還具有光熱轉換效果，可進一步的提升檢測靈敏度（圖5h）。

圖5. 彩色dCNPs@P用于競爭法和夾心法的mLFAs。

這一研究成果發表在國際權威期刊ACS Nano雜志上，論文第一作者為華東師范大學博士研究生田逸塵，通訊作者為華東師范大學張強研究員，海軍軍醫大學第二附屬醫院（上海長征醫院）口腔科王國棟主任，中國農業科學院上海獸醫研究所李濤副研究員。該工作得到了國家自然科學基金(32071383)的支持。

文章鏈接：

Colored Cellulose Nanoparticles with High Stability and Easily Modified Surface for Accurate and Sensitive Multiplex Lateral Flow Assay

Yichen Tian, Lei Chen, Xiaodi Liu, Yuqing Chang, Ruicai Xia, Jing Zhang, Yuele Kong, Yao Gong, Tao Li*, Guodong Wang*, and Qiang Zhang*

https://doi.org/10.1021/acsnano.4c15340

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（責任編輯：xu）

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