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  骨關(guān)節(jié)炎（OA）是以軟骨退化、滑膜炎癥和骨贅形成為特征的慢性退行性關(guān)節(jié)疾病。滑膜巨噬細(xì)胞在OA的滑膜區(qū)尤其豐富且具有顯著的可塑性，可根據(jù)不同的局部微環(huán)境分化為M1或M2表型以參與OA進(jìn)展。M1型滑膜巨噬細(xì)胞通過加重炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，直接損傷軟骨組織或誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡。相反，M2型巨噬細(xì)胞通過產(chǎn)生抗炎細(xì)胞因子來緩解炎癥并促進(jìn)組織修復(fù)。因此，如何實(shí)現(xiàn)巨噬細(xì)胞表型極化和抗氧化的重編程是治療OA的關(guān)鍵策略。

  線粒體自噬功能障礙的巨噬細(xì)胞無法清除受損的線粒體，導(dǎo)致大量活性氧的積累，維持巨噬細(xì)胞M1表型的持續(xù)存在。采用槲皮素（Que）靶向滑膜巨噬細(xì)胞，促進(jìn)線粒體自噬來恢復(fù)線粒體功能穩(wěn)態(tài)是一種調(diào)控巨噬細(xì)胞行為的可行性策略，但其存在水溶性差、半衰期短、藥效不持久、生物利用度低等問題。另一方面，OA患者關(guān)節(jié)部位對氧氣的過度消耗會迫使巨噬細(xì)胞在適應(yīng)乏氧微環(huán)境時優(yōu)先使用糖酵解代謝途徑，這也是驅(qū)動巨噬細(xì)胞向M1表型極化的重要原因，因此緩解乏氧來調(diào)控巨噬細(xì)胞表型同樣具有應(yīng)用潛力。過氧化氫酶（CAT）可以通過直接催化M1巨噬細(xì)胞中過度積累的過氧化氫轉(zhuǎn)為氧氣來補(bǔ)充炎癥部位對氧氣的消耗，然而酶作為一種蛋白類大分子，存在細(xì)胞膜滲透性差、易被降解、體內(nèi)生物利用度較低等亟待解決的問題。

  納米技術(shù)的發(fā)展為解決酶和化療藥物遞送問題提供了重要的解決方案。具有精確分子量分布和三維剛性結(jié)構(gòu)的含磷樹狀或樹冠大分子已發(fā)展成為藥物或蛋白質(zhì)的載體。重要的是，以羥基或亞磷酸鈉末端的含磷樹狀大分子由于其固有的免疫調(diào)節(jié)活性，既可以作為遞送載體，也可以作為治療藥物。因此，構(gòu)建基于含磷樹狀大分子的納米平臺有望將線粒體自噬誘導(dǎo)劑與緩解乏氧的天然酶進(jìn)行有機(jī)結(jié)合，提升藥物和酶的生物利用度，用于重編程巨噬細(xì)胞進(jìn)而調(diào)控成骨免疫微環(huán)境實(shí)現(xiàn)骨關(guān)節(jié)炎的綜合治療。

圖1. G2-OH₂₄/CAT@Que的制備和治療機(jī)制示意圖。

圖2.（A）G2-OH₂₄/CAT和（B）G2-OH₂₄/CAT@Que的水合粒徑分布圖和TEM圖像；不同材料的（C）表面電勢、（D）UV-Vis圖譜和（E）SDS-PAGE圖譜；（F）G2-OH₂₄/CAT@Que在不同分散體系中一周內(nèi)的水合粒徑尺寸變化；（G）不同材料的酶活性；（H）G2-OH₂₄/CAT@Que與蛋白酶K孵育不同時間后的相對酶活力；（I）不同濃度下G2-OH₂₄/CAT@Que的氧氣產(chǎn)生能力。在圖C、E和G中，Ⅰ是CAT；Ⅱ是G2-OH₂₄/CAT；Ⅲ是G2-OH₂₄/CAT@Que。

圖3.（A-B）G2-OH₂₄/CAT@Que促進(jìn)CAT細(xì)胞內(nèi)遞送的流式定量圖和CLSM圖像；（C）RAW264.7細(xì)胞與G2-OH₂₄/CAT@Que共孵育不同時間后細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度的流式細(xì)胞圖；（D）不同內(nèi)吞抑制劑預(yù)處理的細(xì)胞與G2-OH₂₄/CAT@Que培養(yǎng)后細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度的流式定量結(jié)果；（E）不同材料預(yù)處理的細(xì)胞與過氧化氫共孵育24小時后的細(xì)胞活力；（F-G）不同材料處理后的RAW264.7細(xì)胞中氧氣水平變化的流式定量結(jié)果和CLSM圖像；（H）WB分析不同材料處理后細(xì)胞中相關(guān)標(biāo)志蛋白的表達(dá)水平。在圖G中：Ⅰ是PBS；Ⅱ是CAT；Ⅲ是G2-OH₂₄/BSA；Ⅳ是Que；Ⅴ是G2-OH₂₄/CAT；Ⅵ是G2-OH₂₄/CAT@Que。

圖4.（A）WB檢測不同處理后細(xì)胞內(nèi)p-62的表達(dá)水平；不同處理后RAW264.7細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位變化的（B）CLSM圖像和（C-D）流式細(xì)胞術(shù)定量結(jié)果；（E）CLSM觀察不同材料處理后細(xì)胞內(nèi)活性氧的熒光強(qiáng)度。在圖A和B中，Ⅰ是PBS；Ⅱ是LPS；Ⅲ是CAT；Ⅳ是G2-OH₂₄/BSA；Ⅴ是Que；Ⅵ是G2-OH₂₄/CAT；Ⅶ是G2-OH₂₄/CAT@Que。

圖5.（A）不同材料處理后巨噬細(xì)胞極化的流式細(xì)胞圖；（B）不同材料處理后細(xì)胞中CD86和CD163表達(dá)的免疫熒光染色結(jié)果圖；（C）條件培養(yǎng)基的提取和培養(yǎng)示意圖；（D-E）檢測不同材料處理后細(xì)胞上清液中的TNF-α和IL-10的表達(dá)水平。（F）不同條件培養(yǎng)基處理后軟骨細(xì)胞的凋亡和壞死情況；（G）不同條件培養(yǎng)基處理后BMSCs中OCN mRNA的表達(dá)水平；（H）不同條件培養(yǎng)基處理后BMSCs的ALP和茜素紅染色結(jié)果。在圖H中，Ⅰ是PBS；Ⅱ是LPS；Ⅲ是CAT；Ⅳ是G2-OH₂₄/BSA；Ⅴ是Que；Ⅵ是G2-OH₂₄/CAT；Ⅶ是G2-OH₂₄/CAT@Que。

圖6.（A）OA小鼠模型的體內(nèi)治療方案；（B-C）不同治療后小鼠炎癥膝關(guān)節(jié)的番紅-O-固綠染色和OARSI評分結(jié)果。（D-E）不同治療后小鼠炎癥膝關(guān)節(jié)的Mmp-13免疫熒光切片染色和相對熒光強(qiáng)度；（F-I）不同治療后小鼠炎癥膝關(guān)節(jié)的Micro-CT成像圖以及BMD、BV/TV、Tb.Th定量結(jié)果。

圖7.（A）AEMs的提取分離示意圖；（B-C）不同材料處理后AEMs中巨噬細(xì)胞極化的流式細(xì)胞結(jié)果；（D）不同材料處理后AEMs中活性氧水平的流式細(xì)胞術(shù)定量結(jié)果。

  簡而言之，該研究設(shè)計的基于羥基化含磷樹狀大分子的蛋白質(zhì)/藥物共遞送平臺具有多個優(yōu)勢：1）提高CAT和Que的生物利用度，實(shí)現(xiàn)功能藥物的細(xì)胞內(nèi)共遞送；2）通過緩解缺氧和恢復(fù)線粒體穩(wěn)態(tài)，實(shí)現(xiàn)巨噬細(xì)胞向M2抗炎表型極化和抗氧化的重編程；3）利用巨噬細(xì)胞重編程產(chǎn)生的免疫效應(yīng)來重塑骨免疫微環(huán)境，促進(jìn)BMSCs成骨分化并抑制軟骨細(xì)胞凋亡，實(shí)現(xiàn)OA的綜合治療。本研究提出了一種基于含磷樹狀大分子納米藥物的共遞送系統(tǒng)，通過發(fā)揮樹狀大分子、藥物和蛋白質(zhì)的全活性成分的優(yōu)勢，可有效治療OA或其他炎癥性疾病。

  文章鏈接：https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2024.122999