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  在國家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(51833008)和浙江省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(2020C01123)的資助下，浙江大學(xué)申有青教授團(tuán)隊(duì)在核酸和蛋白等生物大分子遞送方面近期取得了三項(xiàng)重要進(jìn)展, 研究成果分別發(fā)表在著名學(xué)術(shù)期刊Advanced Materials（1項(xiàng)）和NanoToday（2項(xiàng)）上。主要研究成果為：1）轉(zhuǎn)染能力不依賴于劑量的聚合物/DNA復(fù)合物(Dose-independent transfection of hydrophobized polyplexes, Advanced Materials 2021)；2）能夠模擬病毒轉(zhuǎn)染過程、像病毒一樣附著在細(xì)胞膜上、以膜融合途徑將自由的DNA直接注入細(xì)胞內(nèi)的聚合物/DNA復(fù)合物(Virus-mimetic DNA-ejecting polyplexes for efficient intracellular cancer gene delivery, NanoToday 2021)；以及3）能夠輸送蛋白、siRNA等生物大分子的平臺(tái)技術(shù)(Polyplex nanovesicles of single strand oligonucleotides for efficient cytosolic delivery of biomacromolecules, NanoToday 2021)。

1、轉(zhuǎn)染效率不依賴于核酸劑量的聚合物/DNA復(fù)合物

  基因療法在腫瘤治療、遺傳疾病等方面具有良好的應(yīng)用潛力，其應(yīng)用瓶頸是高效的核酸遞送系統(tǒng)。陽離子聚合物能夠中和DNA的負(fù)電荷，將其壓縮成陽離子聚合物/DNA復(fù)合物納米顆粒，長期以來被廣泛應(yīng)用于核酸藥物（如治療型DNA和mRNA）的體內(nèi)外基因輸送研究，是常用的非病毒基因載體，但由于其在體內(nèi)的基因轉(zhuǎn)染效率相對(duì)病毒載體較低，極大阻礙了其臨床應(yīng)用。 

  新冠等病毒能夠在人群中傳染，是因?yàn)槠鋯蝹�(gè)病毒就能完成進(jìn)入人體并高效感染人體細(xì)胞的過程。但是，研究發(fā)現(xiàn)陽離子聚合物/DNA納米復(fù)合物的轉(zhuǎn)染能力具有很強(qiáng)的濃度依賴性，其轉(zhuǎn)染能力隨稀釋而降低并在低濃度時(shí)完全失去轉(zhuǎn)染能力。因而當(dāng)應(yīng)用于體內(nèi)系統(tǒng)基因遞送時(shí)，能夠到達(dá)靶組織的復(fù)合物納米顆粒很少、濃度低，導(dǎo)致失去轉(zhuǎn)染能力。因此這種濃度依賴性轉(zhuǎn)染限制了陽離子聚合物/DNA非病毒納米復(fù)合物的體內(nèi)應(yīng)用。

  針對(duì)限制陽離子聚合物轉(zhuǎn)染效率的這一瓶頸問題，浙江大學(xué)申有青教授團(tuán)隊(duì)的張震博士和邱娜莎博士合成了具有一系列結(jié)構(gòu)類似但疏水性可調(diào)的聚甲基丙烯酸酯類聚合物（圖1a），詳細(xì)研究了其DNA轉(zhuǎn)染效率的規(guī)律，發(fā)現(xiàn)復(fù)合物的穩(wěn)定性和內(nèi)吞途徑?jīng)Q定了其轉(zhuǎn)染是否有劑量依賴性（圖1b）：親水性的陽離子聚合物與DNA形成的復(fù)合物是動(dòng)態(tài)的，在低濃度時(shí)，該復(fù)合物顆粒會(huì)解離，剩余的小部分被內(nèi)吞入溶酶體；溶酶體內(nèi)過低濃度的陽離子聚合物無法引起“質(zhì)子海綿效應(yīng)”而無法釋放出DNA，導(dǎo)致失去轉(zhuǎn)染能力。通過系統(tǒng)研究陽離子聚合物疏水性與DNA轉(zhuǎn)染能力之間的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，具有適當(dāng)疏水性的陽離子聚合物與DNA形成的復(fù)合物，即使在低濃度下仍然保持了完整性，且能夠通過巨胞飲的方式進(jìn)入高通透性的巨胞飲體，并直接進(jìn)入胞漿，從而避開了溶酶體陷阱。因此，即使在低濃度下每個(gè)復(fù)合物仍然能夠獨(dú)立完成其感染細(xì)胞的過程，實(shí)現(xiàn)類似于病毒載體的非劑量依賴型DNA轉(zhuǎn)染。

  更進(jìn)一步，該疏水性聚合物形成的復(fù)合物與陰離子聚谷氨酸(γ-PGA)可通過靜電相互作用產(chǎn)生的吸引力與其疏水性/γ-PGA親水性產(chǎn)生的斥力相平衡，使γ-PGA既可以在復(fù)合物表面形成一個(gè)遮蔽層，又可以在接觸細(xì)胞膜時(shí)高效剝離下來，釋放出聚合物/DNA復(fù)合物納米顆粒進(jìn)行非劑量依賴型轉(zhuǎn)染。這些發(fā)現(xiàn)可以為設(shè)計(jì)模擬病毒載體的高效體內(nèi)基因遞送系統(tǒng)提供指導(dǎo)意義。該工作近期以Dose-independent transfection of hydrophobized polyplexes發(fā)表在于 Advanced Materials .

圖1.結(jié)構(gòu)類似但疏水化程度不同的陽離子單體結(jié)構(gòu)及其聚合物（a），及不同疏水性復(fù)合物的基因轉(zhuǎn)染行為和基因轉(zhuǎn)染途徑（b）。b）：i) 高親水性的A100/DNA復(fù)合物通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑進(jìn)入溶酶體；在高復(fù)合物濃度下，內(nèi)涵體/溶酶體含有大量復(fù)合物以裂解內(nèi)涵體，釋放DNA進(jìn)入胞漿實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)染；但在低濃度下大部分復(fù)合物溶脹解離，剩下的部分復(fù)合物進(jìn)入內(nèi)涵體/溶酶體，這些復(fù)合物濃度不足以誘導(dǎo)內(nèi)涵體/溶酶體裂解，從而喪失轉(zhuǎn)染能力。ii) 較疏水性的B75D25可以與DNA復(fù)合形成穩(wěn)定的納米顆粒，即使在非常低的濃度下仍然能夠保持完整性，且可以通過巨胞飲的方式進(jìn)入滲漏型的巨胞飲體，很容易逃逸至胞漿，實(shí)現(xiàn)劑量非依賴性轉(zhuǎn)染。iii) B75D25/DNA復(fù)合物與γ-PGA通過平衡的親和力，形成具有核殼結(jié)構(gòu)的γ-PGA/B75D25/DNA 納米復(fù)合物用于體內(nèi)抑瘤。與細(xì)胞膜接觸后，γ-PGA的外殼脫落下來，釋放B75D25/DNA 復(fù)合物實(shí)現(xiàn)有效轉(zhuǎn)染。

  原文鏈接：https://doi.org/10.1002/adma.202102219

2、仿病毒膜融合基因“注入”型納米復(fù)合物

  現(xiàn)有的陽離子聚合物/DNA復(fù)合物納米顆粒需要通過細(xì)胞內(nèi)吞途徑進(jìn)入細(xì)胞后，再在胞質(zhì)釋放攜載的DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄表達(dá)，導(dǎo)致進(jìn)入細(xì)胞的陽離子基因載體及其降解產(chǎn)物與胞質(zhì)組分（如參與轉(zhuǎn)錄和翻譯的酶、轉(zhuǎn)錄因子和tRNA等生物活性物質(zhì)）產(chǎn)生非特異性地黏附，不僅會(huì)擾亂DNA的轉(zhuǎn)錄過程，降低轉(zhuǎn)染效率，還會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞毒性。此外，陽離子聚合物和DNA分子量都很大，大量的正/負(fù)靜電相互作用使得復(fù)合物納米顆粒在熱力學(xué)上非常穩(wěn)定，使其難以與DNA快速解離，進(jìn)一步降低了陽離子聚合物的轉(zhuǎn)染效率。與之相比，病毒載體（例如噬菌體、腺病毒等）能夠附著在細(xì)胞膜上并對(duì)其打孔，從而將攜載的基因組直接通過孔洞“注入”宿主細(xì)胞的胞質(zhì)溶液中（圖 2a），既有效地避開了溶酶體陷阱造成的DNA降解，又能夠防止載體本身進(jìn)入細(xì)胞對(duì)基因轉(zhuǎn)錄造成干擾，因此具有極高的轉(zhuǎn)染效率。但是，病毒載體的生物安全性較差，容易導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生嚴(yán)重的免疫反應(yīng)和系統(tǒng)毒性，顯著限制了它的臨床應(yīng)用。 

  針對(duì)上述問題，團(tuán)隊(duì)王國偉博士和陳思親博士綜合融匯了病毒載體和非病毒載體的優(yōu)點(diǎn)，設(shè)計(jì)了一種腫瘤特異性酯酶觸發(fā)電荷反轉(zhuǎn)型陽離子聚合物（L4），成功構(gòu)建了一種仿病毒膜融合、基因注入型基因輸送體系（L4/DNA納米復(fù)合物）。通過合成一系列具有不同烷基側(cè)鏈和不同親疏水性的酯酶觸發(fā)電荷反轉(zhuǎn)型陽離子聚合物（圖 2b），篩選出了具有仿病毒膜融合特性的高效基因輸送載體——L4。L4與帶負(fù)電的DNA能夠自組裝形成結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的L4/DNA復(fù)合物納米顆粒（圖 2c, i），表面修飾γPGA能夠顯著提升其血漿穩(wěn)定性和體內(nèi)應(yīng)用（圖 2c, ii）。該體系具有仿病毒膜融合型高效基因轉(zhuǎn)染特性的設(shè)計(jì)關(guān)鍵點(diǎn)之一，在于L4具備適宜長度的辛酰基側(cè)鏈，使其能夠穩(wěn)固地錨定細(xì)胞膜并插入磷脂雙分子層中，將復(fù)合物納米顆粒固定在細(xì)胞膜上并使其部分暴露于細(xì)胞漿（圖 2c, iii）。該載體設(shè)計(jì)的關(guān)鍵點(diǎn)之二，是利用了細(xì)胞漿內(nèi)含有大量的酯酶能夠快速水解L4中的酚基酯，并進(jìn)一步觸發(fā)自催化酯鍵水解反應(yīng)產(chǎn)生帶負(fù)電的聚丙烯酸，從而解離釋放DNA（圖 2c, iv）；與此同時(shí)，聚丙烯酸與DNA自身的強(qiáng)靜電互斥作用，能夠?qū)NA直接“注入”細(xì)胞質(zhì)中實(shí)現(xiàn)高效的基因轉(zhuǎn)染（圖 2c, iv）。

  因此，通過載體的電荷反轉(zhuǎn)和膜融合的設(shè)計(jì)，γPGA/L4/DNA基因輸送體系成功融合了病毒載體和非病毒載體的優(yōu)點(diǎn)，使其與腫瘤細(xì)胞接觸后能夠以仿病毒膜融合的基因遞送形式，將攜載的DNA直接“注入”細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，不但規(guī)避了細(xì)胞內(nèi)吞的陽離子載體造成的細(xì)胞毒性和對(duì)基因轉(zhuǎn)染的干擾，而且防止了溶酶體陷阱導(dǎo)致的DNA降解。該基因輸送系統(tǒng)為進(jìn)一步開發(fā)模擬病毒載體的高效體內(nèi)基因遞送系統(tǒng)提供了指導(dǎo)基礎(chǔ)。相關(guān)研究成果以“Virus-mimetic DNA-ejecting Polyplexes for Efficient Intracellular Cancer Gene Delivery”為題，于2021年6月11日發(fā)表于Nano Today上。

圖 2. 膜融合基因“注入”型納米復(fù)合物示意圖。(a) 許多病毒通過膜融合途徑將基因組“注入”宿主細(xì)胞中。（b）具有不同烷基側(cè)鏈的酯酶觸發(fā)電荷反轉(zhuǎn)型陽離子聚合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其電荷反轉(zhuǎn)機(jī)理。（c）γPGA/L4/DNA的制備方法及基因輸送途徑：DNA被L4壓縮成結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的復(fù)合物納米顆粒后i)，用γPGA包被 ii)；一旦接觸細(xì)胞，γPGA可以剝離并暴露 L4/DNA，然后 L4 的長酰基鏈插入脂質(zhì)雙層并將 L4/DNA 錨定在細(xì)胞膜上 iii)；部分朝向細(xì)胞質(zhì)的 L4 被胞質(zhì)酯酶觸發(fā)電荷反轉(zhuǎn)而產(chǎn)生負(fù)電荷iv)，從而通過強(qiáng)靜電互斥作用將 DNA擠壓“注入” 細(xì)胞內(nèi)實(shí)現(xiàn)高效的基因轉(zhuǎn)染。 

  原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.nantod.2021.101215

3、基于單鏈寡聚核苷酸的聚合物納米囊泡用于生物大分子輸送

  向細(xì)胞內(nèi)高效遞送具有治療功能的基因或蛋白質(zhì)等生物大分子是當(dāng)今生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，而安全高效的生物大分子遞送系統(tǒng)是其應(yīng)用的瓶頸。陽離子聚合物是廣泛研究的非病毒載體，但普通的陽離子聚合物（如PEG-PLL）等難以與短鏈、剛性的siRNA和電荷密度低且分布不均的蛋白形成穩(wěn)定、輸送效率高的納米顆粒。雖然提高陽離子電荷密度可解決這一問題上，但高電荷密度顯著提高載體的細(xì)胞毒性。浙大申有青教授團(tuán)隊(duì)周泉博士（現(xiàn)為浙大基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院研究員）和相佳佳博士發(fā)現(xiàn)鏈結(jié)構(gòu)柔順、分子量相對(duì)較小的單鏈寡聚核苷酸，與PEG-PLL可形成復(fù)合物納米囊泡，能夠高效負(fù)載多種蛋白和siRNA，并將其高效地輸送到細(xì)胞內(nèi)（圖3a）。用含20個(gè)氟尿嘧啶單元的功能性寡聚核苷酸單鏈F20，與PEG-PLL構(gòu)建囊泡F20some，并對(duì)其蛋白和siRNA體內(nèi)外輸送特性進(jìn)行了系統(tǒng)研究，同時(shí)輸送F20和具有協(xié)同作用的siRNA或者功能蛋白，獲得了高抗腫瘤活性的納米制劑（圖3b）。

  該方法中單鏈核苷酸可為如適配子（Aptamers）、CpG甚至microRNA等各種核苷酸序列，因而是一個(gè)普適、高效、低毒的基因和蛋白等大分子輸送平臺(tái)。但如何進(jìn)一步提高該囊泡在生理環(huán)境中的穩(wěn)定性依然是未來研究的重點(diǎn)。該工作以Polyplex nanovesicles of single strand oligonucleotides for efficient cytosolic delivery of biomacromolecules 發(fā)表在近期 Nano Today上。

圖3. （a）基于單鏈寡聚核苷酸的聚合物納米囊泡的構(gòu)建；（b）以F20作為功能型寡聚核苷酸單鏈構(gòu)建納米囊泡F20some，并選取siBCL-2和RNase A作為模型siRNA和蛋白，研究了F20some對(duì)siBCL-2和RNase A的胞內(nèi)遞送效果和細(xì)胞內(nèi)的協(xié)同凋亡作用。

  原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.nantod.2021.101221