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暨大劉明賢教授團隊 Nano Today: 含有多酚@埃洛石的海藻酸鹽微球用于益生菌遞送和炎癥性腸病治療

2025-02-19 來源：高分子科技

炎癥性腸病（IBD）是一種慢性、復發性腸道炎癥性疾病，常表現為腹痛、腹瀉和便血，全球超過700萬人受此困擾。臨床治療主要通過抑制腸道炎癥來緩解疾病相關癥狀，然而傳統藥物常存在靶向不足、粘膜屏障滲透有限等缺點，長期使用具有嚴重的副作用。埃洛石納米管（HNTs）是礦物藥“赤石脂”的主要成分，可用于治療腹瀉、潰瘍和便血。口服益生菌療法通過調節微生物平衡和生物活性物質的產生而備受關注。然而，由于缺乏抗氧化劑，炎癥性腸道微環境易對益生菌造成氧化損傷。因此，開發同時包覆益生菌和抗氧化劑的新策略具有重要意義。

近日，暨南大學化學與材料學院劉明賢教授團隊利用茶多酚 (EGCG) 良好的粘附性和金屬配位能力對HNTs進行功能化(MPN@HNTs)，將其與海藻酸鈉溶液共混制備MHBSA水凝膠微球, 用于益生菌遞送和炎癥性腸病的靶向治療。該研究成果以“Orally administered hydrogel containing polyphenol@halloysite clay for probiotic delivery and treatment of inflammatory bowel disease”為題發表在Nano Today期刊上。暨南大學化學與材料學院博士生陳翔宇為該論文第一作者，劉明賢教授為唯一通訊作者。

圖1a 展示了MPN@HNTs的制備過程：在弱堿性條件下，將HNTs超聲分散在溶液中，依次添加 Fe³⁺ 和 EGCG溶液并劇烈攪拌，使金屬多酚網絡 (MPN) 修飾到HNTs表面，合成 MPN@HNTs。通過TEM、SEM和元素能譜分析確定了MPN 成功負載在 HNTs 表面。HNTs表面涂覆 MPN 后，尺寸從388.9±4.5 nm 增加到 414.8±4.2 nm，Zeta電位從 -17.6±0.6 mV降為 -30±1.3 mV。紅外光譜和紫外可見光光譜證明了多酚和金屬離子之間的成功配位。

圖1. MPN@HNTs 的合成與表征。(a) 制備示意圖。(b) TEM 照片。(c) SEM 照片。(d) 元素能譜分析。(e) 粒度。(f) Zeta 電位。(g) FTIR 光譜。(h) UV-vis 光譜。(i) XPS全譜圖。(j) Fe 2p、k) C 1s、和l) O 1s的 XPS 譜圖。

圖2a 展示了MHBSA 水凝膠微球的制備過程：將MPN@HNTs和BL在海藻酸鈉溶液中混合，采用氣動泵動態擠出技術構建海藻酸微球體系（MHBSA）。通過SEM觀察和元素能譜分析發現，MPN@HNTs在微球中均勻分布。MHBSA與IEC-6和RAW 264.7細胞共培養，細胞增殖不受影響，表現出良好的細胞相容性。微球在模擬胃液中2h仍保持完整的球形結構，但在模擬腸液中迅速溶脹，這一結果說明MHBSA微球能夠耐受酸性胃環境并能成功在腸道環境中釋放內容物。與海藻酸鹽微球相比，在微球中添加MPN@HNTs后可明顯提高益生菌在模擬胃液中的存活率，在模擬胃液中孵育2h后存活率仍可達81.7%，這是由于MPN@HNTs填充在水凝膠孔隙中，有效阻止了有害物質的進入。

圖2. MHBSA微球的制備、表征及穩定性測試。(a) 制備示意圖。(b) SEM 照片。(c) SEM放大照片。(d) 粒度分布。(e) 元素能譜分析。(f) 活/死染色熒光顯微鏡照片。(g) 在模擬胃液和腸液中SGF 中浸泡 2 小時然后轉移到 SIF 的 MHBSA 微球的數字和熒光顯微鏡圖像。(h) 在 SGF 中孵育不同時間段后，商業益生菌、嵌入 MHBSA 和 BSA 的 BL 的存活率。

清除炎癥部位過量的ROS和促炎細胞因子是IBD治療的關鍵。圖3a顯示細胞攝取MPN@HNTs具有時間依賴性，這是MPN@HNTs在細胞內發揮功效的先決條件。相關實驗結果表明，MPN@HNTs可以有效清除LPS誘導下細胞產生的ROS并降低細胞中促炎細胞因子（IL-6、IL-1β和TNF-α）的表達。除LPS外，還采用H₂O₂處理細胞建立氧化應激模型，50 μg mL^-1MPN@HNTs預處理可以減輕H₂O₂造成的氧化損傷，細胞活/死染色顯示PI陽性細胞數量明顯減少，細胞活力得以提升。此外，不同條件下的益生菌在模擬炎性結腸液中培養2小時后，平板計數結果顯示MPN@HNTs預處理可以提高益生菌的存活率。基于這些體外 ROS 清除、抗炎作用和生物相容性的結果，MPN@HNTs 被認為在 IBD 治療中具有巨大的潛力。

圖3. 體外抗炎和抗氧化性能測試。(a) RAW 264.7對MPN@HNTs的攝取行為。(b) DCFH-DA染色的RAW 264.7的熒光照片。(c) 流式細胞技術分析。(d) 活/死染色照片。(e) 細胞活力檢測。(f) 平均熒光強度。(g-i) IL-1β、TNF-α、IL-6 mRNA 的相對表達水平。(j) 不同處理后巨噬細胞的形態。（k）菌落照片。（l）采用平板計數法計算細菌量。（m）不同處理條件下BL的存活率。

IBD發病時，伴隨著腸內容物浸潤到炎癥區域，大量陽離子蛋白（如轉鐵蛋白、抗菌肽等）在結腸黏膜表面聚集。MHBSA微球在腸道環境中釋放MPN@HNTs和益生菌。MPN@HNTs的強負電荷和豐富的酚羥基驅使它們聚集在腸道炎癥部位（圖4）。體外模擬實驗中，將健康和結腸炎小鼠的結腸段（1 cm）與MPN@HNTs在37°C下孵育，熒光成像照片顯示，炎癥結腸中滯留材料的熒光強度明顯高于健康結腸。體內實驗給小鼠口服等量MHBSA，24 h后全腸道熒光成像照片和定量分析顯示，腸炎小鼠結腸組織中MPN@HNTs黏附和滯留較多。以上結果表明材料可通過延長胃腸道滯留時間，提高口服利用度，從而實現結腸炎靶向治療。

圖4. 炎癥腸道粘附測試。(a) 結腸粘膜示意圖。(b) 遠端結腸與MPN@HNTs在體外孵育后的熒光照片。(c) 口服MHBSA 24小時后，胃腸組織的熒光照片。(d) 結腸與MPN@HNTs在體外孵育后的總輻射效率。(e) 口服MHBSA 24小時后，結腸中的總輻射效率。(f) 口服MHBSA后，不同時間點胃腸道的熒光照片。(g) 使用IVIS成像系統量化的總輻射效率。

為了進一步證明該策略的可行性，驗證了MHBSA在DSS誘發的結腸炎小鼠模型中的治療效果（圖5）。MHBSA可有效緩解結腸炎小鼠的一系列癥狀，包括體重降低、脾腫大、濕尾和便血現象。該材料的止血止瀉作用歸因于HNTs通過吸水濃縮血液、激活血小板和凝血途徑來止血。治療結束后收集各組小鼠的結腸組織進行組織學分析。蘇木精和伊紅染色結果顯示，DSS組結腸絨毛和隱窩結構受損嚴重，伴有大面積潰瘍和大量免疫細胞浸潤。相比之下，MHBSA治療組微絨毛完整，指狀隱窩結構規則，炎癥細胞所占百分比低，形態接近對照組。MPN@HNTs表現出一定的治療效果，但效果未達到MHBSA的水平，該結果展示了MPN@HNTs在增強MHBSA對IBD治療效果方面的作用。

圖5. MHBSA微球對DSS誘發的結腸炎小鼠的治療效果。(a) 動物實驗設計示意圖。(b) 小鼠體重每日變化。(c) DAI評分。(d) 濕尾和便血的代表性照片。(e) 治療后各組小鼠脾臟照片。(f) 治療后各組小鼠結腸照片。(g) 結腸組織H&E染色照片。(h) 便血指數。(i) 腹瀉指數。(j) 結腸長度量化。(k) 脾臟重量量化。(l) 組織學評分。

通過組織學分析，證明MHBSA可以有效修復腸道粘膜屏障（圖6）。Occludin和ZO-1是腸道中兩種主要的緊密連接蛋白，與腸道屏障的完整性直接相關。采用免疫熒光染色分析結腸組織中Occludin-1和ZO-1緊密連接蛋白的表達。健康組和MPN@HNTs和MHBSA治療組均觀察到明亮的紅色和綠色熒光，這表明不同治療均能不同程度地恢復緊密連接蛋白的表達。粘蛋白構成腸道粘液層，由杯狀細胞產生，阻止有害物質和病原體的進入。阿利新藍-過碘酸雪夫染色結果顯示，對照組和 MHBSA 處理組均出現豐富的杯狀細胞，且杯狀細胞數量明顯高于 DSS 處理組。

圖6. MHBSA促進組織修復。（a）Occludin 免疫熒光照片。（b）Occludin 的定量分析。（c）ZO-1 免疫熒光照片。（d）ZO-1 的定量分析。（e）AB-PAS 染色。（f）杯狀細胞所占面積分析。

通過多種炎癥指標對治療效果進行綜合評價，MHBSA可有效緩解DSS引起的結腸損傷和免疫反應(圖7)。與模型組相比，MHBSA處理后減輕了氧化應激引起的 DNA 損傷，表現為結腸炎癥部位的4-HNE（脂質過氧化標志物）和 8-OHDG（DNA 損傷標志物）的熒光強度減弱。進一步研究了 MHBSA 對結腸炎小鼠的抗炎作用。MPN@HNTs和MHBSA治療后顯著抑制結腸組織中促炎因子IL-6、IL-1β和TNF-α的表達，促進抗炎因子IL-10的表達。蛋白質印跡法和免疫組織化學結果顯示MHBSA抑制了DSS誘導的腸道組織中TLR4、MyD88和NF-κB蛋白表達的上調，說明抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路的激活可能是MHBSA發揮抗炎作用的藥理機制。

圖7. MHBSA 微球抑制腸道炎癥。（a-c）4-HNE 和 8-OHDG 的免疫熒光照片及定量分析。（d - g）炎癥因子的mRNA表達水平。（h）通過免疫印跡檢測TLR4、MyD88 和 NF-κB 的蛋白質表達水平。（i - k）蛋白質表達水平的定量分析。

為了探討MHBSA對小鼠腸道菌群的調控作用，利用16S rRNA測序技術分析結腸炎小鼠糞便微生物的組成和豐度 (圖8)。微生物產生的短鏈脂肪酸（SCFAs）具有優良的抗炎特性，在緩解免疫系統紊亂以及維持腸道穩態中發揮重要作用。MHBSA處理后可以增加產SCFAs有益菌（Lachnospiraceae和Firmicutes）的豐度。綜合分析不同生物水平上不同處理組的微生物組成，MHBSA治療組小鼠的腸道菌群更接近健康小鼠。綜上所述，MHBSA 通過調節腸道微生物群的組成，在IBD的治療中發揮了積極作用。

圖8. 腸道菌群 16S rRNA 測序分析。（a-c）Shannon 指數（a）、Simpon 指數（b）和 Chao1 指數（c）。（d）基于unweighted unifrac 距離矩陣熱圖的 ρ多樣性指數分析。（e）門水平腸道微生物相對豐度直方圖。（f）科水平不同物種相對豐度直方圖。（g）基于 metagenomeSeq 結果的目水平物種和組間功能差異熱圖。（h）KO 功能的相對豐度直方圖。（i）基于unweighted unifrac 距離的腸道菌群的主坐標分析 (PCoA)。（j）基于 Bray-Curtis指標的腸道菌群的主坐標分析 (PCoA) 圖。（k）功能豐度聚類圖。

緩解炎癥、調節腸道菌群是治療IBD的關鍵，但單一組分藥物或益生菌的治療效果有限。受Smecta®、Hemospray等礦物藥的啟發，本研究成功構建了含多酚修飾納米黏土埃洛石和益生菌的水凝膠微球體系，用于IBD的靶向治療。HNTs的強負電荷驅使MPN@HNTs靶向遞送到炎癥微環境并增強其在炎癥腸黏膜中的滯留時間，減少了脫靶引起的全身副作用。HNTs通過吸收出血部位的水分并和血液發揮作用，實現止瀉止血。抗氧化防御系統與益生菌的結合增加了結腸炎小鼠中有益菌的豐度，協同發揮調節腸道菌群作用。因此，含有HNTs和益生菌的pH響應性載藥系統為IBD的治療提供了新的方案。
該論文得到了國家自然科學基金（52073121）、佛山國家高新技術產業開發區產業化創業團隊計劃（2220197000129）項目和中央高校基礎研究基金（21624115）的資助。

論文鏈接：

https://authors.elsevier.com/c/1kdDa6DSyBLhtW

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1748013225000416

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（責任編輯：xu）

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