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  為了實現預防、診斷、治療等藥效功能，生物大分子藥物往往需要穿透細胞膜進入胞內。因此，生物藥物胞內遞送是生物藥物面臨的一個關鍵問題。由于光介導的胞內遞送方法具有較好的通用性和調控性，適用于各類細胞和各種生物藥物的遞送，尤其是在體外或離體處理的情況，因此受到了越來越多的關注。

  黃超伯/熊燃華課題組長期致力于功能性生物大分子胞內遞送研究，利用光熱納米顆粒（NPs）富集于細胞表面進行光穿孔，光熱NPs產生的瞬時光熱效應可以將功能性生物大分子溫和地遞送至活細胞中，適用于多種細胞類型和生物大分子。然而，該光穿孔技術依賴于細胞與光熱NPs的直接接觸，這在臨床應用中，特別是在癌癥患者自體免疫T細胞功能化改造過程中，面臨安全性和監管的諸多挑戰。為此，研究團隊創新性地提出了一種基于光熱靜電紡納米纖維（PEN）介導的光穿孔技術。該技術通過將光熱NPs嵌入靜電紡納米纖維中，作為細胞培養的基底，利用光熱效應誘導細胞膜透化，進而有效遞送生物大分子至各種細胞類型。與傳統方法相比，該技術避免了細胞與NPs的直接接觸，從而顯著降低了安全性和監管風險。與常用的物理轉染方法——電穿孔相比，PEN光穿孔對細胞的損傷更小，能夠獲得更高質量的工程化改造細胞，展現出更強的臨床治療潛力（Nat. Nanotechnol. 2021, 16, 1281、Adv. Mater. 2021, 33, 2008379、Nat. Commun. 2022, 13, 1996）。

圖1. PEN光穿孔用于胞內遞送的詳細步驟。（1）靜電紡絲制備包載光熱納米顆粒的PEN納米纖維基底。（2）PEN基底和細胞共培養。（3）PEN光穿孔激光輻射平臺。（4）利用模型大分子優化PEN光穿孔參數。（5）采用優化的PEN光穿孔方案，將功能大分子遞送至各種類型細胞。（6）體外和體內驗證PEN光穿孔工程化改造CAR-T細胞的治療效果。

圖2. PEN 光穿孔參數優化用于 HeLa貼壁細胞和 Jurkat 懸浮細胞的遞送。（a）在有和無膠原涂層的 PEN 基底上生長的 Calcein AM 標記的 HeLa 細胞的共聚焦圖像。（b）HeLa 細胞在不同激光能量和光熱NPs 濃度下的 RD10遞送效率和細胞活性。（c）深紅色熒光 CellMask 標記的 Jurkat 細胞在香豆素6標記的 PEN基底上的共聚焦圖像。（d）Jurkat 細胞在不同激光能量、光熱NPs 濃度、和重復激光照射下的FD10遞送效率和細胞活性。

圖3. PEN 光穿孔應用于功能大分子siRNA或CRISPR-Cas9 RNPs的胞內遞送研究。（a）共聚焦顯微鏡顯示了使用 1 wt% 光熱NPs 和 0.08 J cm^?2 激光能量進行 PEN 光穿孔處理的對照組和 siGFP胞內遞送的 H1299 細胞eGFP 的表達。（b,c）不同 siGFP 濃度或在低濃度 0.5 μM siGFP下重復 PEN 光孔化處理時，H1299 細胞eGFP 表達的 MFI 和 eGFP 敲低效率。（d）共聚焦顯微鏡顯示了光穿孔將CRISPR-Cas9 RNPs遞送到H1299細胞以敲除GFP表達。（e,f）不同 RNP 濃度或在低濃度 0.5 μM RNP下重復 PEN 光孔化處理時，H1299 細胞eGFP 表達的 MFI 和 eGFP 敲除效率。

圖4. PEN光穿孔用于人T細胞高效安全的生物大分子胞內遞送及其腫瘤細胞殺傷功能。（a）PEN光穿孔方法遞送小干擾核酸siPD1到T細胞以抑制PD1蛋白表達。（b）使用優化的 PEN 光孔化參數（5 wt% 光熱NP濃度，0.16 J cm^?2 激光能量和 NaOH 水解的 PENs）時，siPD1 濃度變化對人類 T 細胞中 PD1 敲低效率的影響。（c）靜脈注射CAR-T細胞(陰性對照)、PEN光穿孔處理的CAR T 細胞（攜帶 siPD1，實驗組）和與PD1 抗體聯合使用的 CAR T 細胞（陽性對照）的腫瘤大小隨時間變化。

  論文鏈接：https://doi.org/10.1038/s41596-024-01115-7

  實驗室主頁：https://www.x-mol.com/groups/nfu-ugent