骨關節炎（OA）是一種常見的慢性關節疾病，其主要特征為軟骨損傷、滑液潤滑減少和關節摩擦增加。在OA的早期階段，軟骨損傷會引起的關節摩擦增加，進而加劇了軟骨細胞基因的異常表達，觸發了一系列相關的生物反應，包括基質降解酶的釋放、促炎細胞因子的分泌，以及細胞的沉默或衰老等。成纖維細胞生長因子18（FGF18）是OA發展中被異常沉默的關鍵基因之一，在軟骨再生過程中對細胞增殖和分化具有至關重要的作用。研究發現，FGF18能夠抑制OA的發展，并在各種動物模型中展現出良好的軟骨損傷愈合能力。目前，人源重組FGF18（也稱為sprifermin）正在進行關節應用的臨床試驗。然而，作為一種蛋白質藥物，sprifermin面臨著一些挑戰，包括其半衰期短、遞送效率低，以及需要反復進行關節注射等問題。因此，尋找新的治療策略以克服這些挑戰，對于改善OA患者的生活質量具有重要意義。
針對以上問題，四川大學張興棟院士團隊王啟光/樊渝江報道了一種基于CRISPR/Cas9在體基因編輯的方法，利用可特異性靶向軟骨細胞的雜化外泌體（CAP/FGF18-hyEXO）裝載FGF18基因編輯工具，有效地在體內基因組層面激活OA軟骨細胞的FGF18基因。在此基礎上，利用微流控和光聚合技術將其包封于甲基丙烯酸酐修飾的透明質酸（HAMA）可注射性微凝膠中，通過脂質邊界效應形成自我更新的水合層，為運動時的關節摩擦提供持久的潤滑作用。研究發現，結合體內FGF18基因編輯和持續潤滑可協同促進軟骨再生、減輕炎癥和防止軟骨基質降解，具有較大的臨床應用潛力。該工作以“Injectable microgels with hybrid exosomes of chondrocyte-targeted FGF18 gene-editing and self-renewable lubrication for osteoarthritis therapy”在國際權威期刊Advanced Materials上發表。王啟光副研究員和樊渝江教授為該文的通訊作者，四川大學生物醫學工程學院博士生陳曼雨為文章第一作者。這項研究得到了國家自然科學基金委面上項目（32071353）的支持。
圖1 具有軟骨細胞靶向性在體FGF18基因編輯和自我再生潤滑功能的可注射性雜化外泌體微凝膠用于骨關節炎治療的示意圖
為實現FGF18的精準在體編輯，研究團隊首先轉染并篩選出穩定表達CAP/EGFP-Lamp2b質粒與Cas9質粒的HEK293細胞，并通過超高速離心得到該細胞的外泌體CAP/EXO。接著，通過膜融合將CAP/EXO與負載SgFGF18的脂質體進行雜化，構建了負載FGF18基因編輯工具的雜化外泌體CAP/hyEXO（圖1）。制備的CAP/hyEXO的粒徑大小與細胞外泌體CAP/EXO相似（約150-220 nm），呈現出球形囊泡的形態，并保留了外泌體的特異性膜蛋白，同時顯示出優秀的穩定性。細胞實驗表明，CAP/FGF18-hyEXO可顯著提高軟骨細胞中FGF18基因的表達，證明了Cas9-SgFGF18具有有效的FGF18基因調控能力（圖2）。
圖2. CAP/hyEXOs的制備和表征
研究人員利用基因工程技術成功實現了軟骨親和肽CAP對雜化外泌體CAP/hyEXO的修飾，以確保Cas9-SgFGF18在體內精準遞送至軟骨細胞。通過活體成像追蹤CAP/hyEXO在關節部位的滯留情況，發現CAP/FGF18-hyEXO在關節腔內留存長達7天，并且不會脫靶積聚在其他器官中（圖3）。CAP/hyEXO表面微弱的正電荷特性，也間接地增強了其關節內的靶向能力：由于分子靜電力作用，促使更多的CAP/hyEXO粘附聚集于帶負電荷的關節表面，并進一步固定在軟骨組織內帶負電的糖胺聚糖鏈接（圖3）。
圖3. CAP/hyEXOs的體內外細胞靶向性研究
隨后，研究人員利用微流控和光聚合技術將雜化外泌體CAP/hyEXO包封于甲基丙烯酸酐修飾的透明質酸（HAMA）為基體材料的微凝膠中，獲得了CAP/hyEXO均勻分散、平均粒徑為189.82±19.53μm的可注射微凝膠CAP/hyEXO@HMs。其中，CAP/hyEXO表面的陽離子和透明質酸聚合物鏈中的陰離子的通過靜電分子力形成的緊密的網絡結構，實現了CAP/hyEXO的緩慢釋放和CAP/hyEXO@HMs緩慢降解，延長在關節內的作用時間（圖4）。同時，與透明質酸微球相比，可注射性微凝膠CAP/hyEXO@HMs在往復摩擦磨損試驗中能保持穩定的低摩擦系數（COF≈0.2）。CAP/hyEXO@HMs優異的潤滑性能主要歸因于脂質邊界效應機制：CAP/EXO@HMs可作為CAP/hyEXO的儲存層，在磨損過程中導致CAP/hyEXO的不斷暴露，可實現穩定的水潤滑。CAP/hyEXO@HMs優異的潤滑性能，能有效減輕關節磨損（圖4）。
圖4. 可注射CAP/hyEXO@HMs微凝膠的制備和表征
進一步地，利用IL-1β誘導的OA軟骨細胞模型研究了CAP/hyEXO@HMs對OA軟骨細胞的治療作用。體外細胞實驗表明，CAP/hyEXO@HMs具有良好的細胞相容性，能夠促進OA軟骨細胞增殖、遷移、軟骨相關基質分泌和ECM合成（圖6），并利用分子生物學手段，進一步揭示了CAP/++FGF18-hyEXO@HMs對OA軟骨細胞的治療的作用機制，發現通過FGF18上調激活了PI3K/AKT信號通路，從而促進ECM再生，同時抑制炎癥和基質降解（圖6）。
圖5.CAP/++FGF18-hyEXO@HMs促進OA軟骨細胞的增殖、遷移和ECM合成
圖6.CAP/++FGF18-hyEXO@HMs通過調控PI3K/ATK信號通路促進OA軟骨細胞再生軟骨基質
為評價 CAP/++FGF18-hyEXO@HMs的體內治療效果，研究人員在基于ACLT法建立的大鼠膝關節OA模型中進行了關節腔注射，并于術后8周和12周進行了影像學和組織學分析。結果顯示，CAP/++FGF18-hyEXO@HMs組的骨贅形成少，軟骨基質再生增加，與軟骨ECM蛋白、炎癥、基質降解和PI3K信號通路相關的特定基因表達增強（圖7）。同時，通過轉錄組學分析，進一步地確認了CAP/++FGF18-hyEXO@HMs的體內FGF18基因編輯和持續潤滑在關節炎治療中的協同作用，并探索了相關的作用機理（圖8），有利于在未來的研究中進一步開發和優化基于在體基因編輯的骨關節炎治療方案。
圖7 可注射CAP/++FGF18-hyEXO@HMs微凝膠治療OA大鼠的效果表征
圖8可注射CAP/++FGF18-hyEXO@HMs微凝膠治療OA大鼠的轉錄組分析
這項工作是該團隊近期對工程化外泌體平臺構建的最新進展之一。該研究創新性地采用基于CRISPR的基因療法和微流控技術制備了一種可注射的CAP/FGF18-hyEXO@HMs，具有高效的體內FGF18基因編輯和持續潤滑功能，有望解決人源重組FGF18蛋白質藥物的半衰期短、遞送效率低，并需要反復關節注射等因缺陷。CAP/FGF18-hyEXO@HMs在體外和體內均顯示出協同促進軟骨再生、減輕炎癥和防止ECM降解的能力。本研究為基于CRIPSR基因編輯的OA治療提供了新思路，有望進一步應用于骨關節炎的臨床治療中。
論文信息：Manyu Chen, Yan Lu, Yuhan Liu, Quanying Liu, Siyan Deng, Yuan Liu, Xiaolin Cui, Jie Liang, Xingdong Zhang, Yujiang Fan, Qiguang Wang, Injectable Microgels with Hybrid Exosomes of Chondrocyte-Targeted FGF18 Gene-Editing and Self-Renewable Lubrication for Osteoarthritis Therapy. Adv. Mater. 2024, 2312559.
https://doi.org/10.1002/adma.202312559
