腦出血手術后的術后再出血與高死亡率密切相關，但目前尚無有效的臨床治療方法。在本研究中，他們開發了一種血紅蛋白（Hb）響應性的原位植入式DNA水凝膠，該水凝膠包含與兩條互補鏈交聯的Hb適體，并封裝了甲磺酸去鐵胺（DFO）。功能性地，該水凝膠在術后再出血時通過捕獲Hb產生信號，展現出獨特的“自我診斷”能力。此外，持續捕獲Hb會介導水凝膠的逐漸解體，從而實現DFO的按需釋放，而不會影響生理鐵依賴功能。這一過程通過抑制神經細胞的鐵死亡來實現自我治療。在膠原酶和自體血液注射模型誘導的模擬術后再出血模型中，該水凝膠展示了鐵吸收效率的5.58倍提升，顯著減少了血腫大小（從8.674立方毫米減少到4.768立方毫米）。這種創新的Hb響應性DNA水凝膠不僅為術后再出血提供了治療干預，而且還提供了自我診斷反饋，為提高臨床治療效果帶來了顯著的希望。
腦出血（ICH） 是一種危重疾病，其特征是血液突然自發滲入腦實質。它是第二常見的中風亞型，因其極高的死亡率和發病率而引起極大關注。手術干預具有預防腦疝和減輕血腫對周圍組織的病理生理影響的潛力。然而，由手術引起的術后再出血風險仍然普遍。此外，盡管具有減少占位效應、改善顱內壓和增強腦灌注的好處，但手術的浸潤性往往會留下殘留產物，影響患者的預后，并可能導致嚴重病例的再出血。再出血的發生可能不容易被發現，導致錯失挽救機會和隨之而來的致命結果。
在此，他們設計了一種血紅蛋白（Hb）響應性原位植入式DNA水凝膠的構建和特性。這種水凝膠由Hb適體與兩條互補鏈交聯而成，并封裝了甲磺酸去鐵胺（DFO）。其設計原理是，在術后再出血的情況下，水凝膠能夠通過捕獲Hb發出信號，實現自我診斷。同時，Hb的持續捕獲會觸發水凝膠的逐步解體，從而按需釋放DFO，這一過程不會干擾鐵依賴性的生理功能，并通過抑制神經細胞的鐵死亡達到自我治療的目的。
圖1.原位植入式DNA水凝膠用于腦出血術后再出血的診斷與治療
2. DNA 水凝膠的合成
為篩選與 Hb 特異性結合的最優核酸鏈，首先，通過磁珠實驗證明當 DNA B 鏈與適配體 7 個堿基配對時 Hb 的特異性最強并以 7 個堿基互補作為后續的核酸鏈。通過瓊脂糖電泳實驗證明丙烯酰胺基團修飾的 DNA-A（Strands-A, S-A） 和丙烯酰胺修飾的 DNA-B（Strands-B, S-B）成功連接到聚丙烯酰胺上。后續在合成的聚合物 A 鏈（Polymer strands A, PS-A）和聚合物 B 鏈（Polymer strands B, PS-B）混合溶液中加入 Hb適配體后，PS-A和 PS-B的混合溶液流動性明顯降低，證明 DNA 水凝膠成功合成。
圖2.DNA水凝膠的合成
3. DNA 水凝膠的特性
為了篩選有較好注射性能且與腦部模量相匹配的 DNA 水凝膠，分別制備了 0.3、0.7 和 1 mM Hb 適配體濃度交聯的 DNA 水凝膠。考察了三種 DNA 水凝膠的可注射性、流變性、膨脹率、溶膠率以及藥物包封率。結果證明 0.7 mM 交聯的 DNA 水凝膠具備可注射性且儲存模量與大腦模量相匹配（200 Pa）。通過測定三種 DNA 水凝膠溶膠率以及藥物包封率，結果證明 0.7 mM DNA 水凝膠的溶膠率可以達到 60%并且 0.7 mM 的包封率與 1 mM 的包封率相接近可達到 87%。綜上，0.7 mM Hb 適配體交聯的 DNA 水凝膠具有合適的機械性和特異性，采用 0.7 mM 交聯濃度作為后續的實驗條件。
圖3. DNA水凝膠的特性
4. DNA 水凝膠響應性藥物釋放的研究
基于上述所篩選出的合適的 DNA 水凝膠，考察了該 DNA 水凝膠體外的特異響應性。首先采用掃描電鏡（Scanning electron microscope, SEM）和流變儀測定了在加入 Hb 后 DNA 水凝膠孔徑和模量變化，實驗證明當加入 Hb 后 DNA 水凝膠孔徑變大，儲存模量降低至 16 Pa 左右。其次也考察了 DNA 水凝膠的特異性、選擇性和靈敏性。以突變適配體交聯的未響應 DNA 水凝膠（No-responsive gel, No-res. gel）為對照，驗證響應 DNA 水凝膠可以實現特異性溶膠，以牛血清白蛋白（Bovine serum albumin, BSA）為對照，證明 DNA 水凝膠僅對 Hb 有特異選擇性。最后考察了不同濃度 Hb 的溶膠率，DNA 水凝膠對 Hb 有明顯的濃度依賴和時間依賴性。同時，驗證了 DNA 水凝膠藥物釋放率，結果表明在 120 min時達到藥物釋放飽和且呈現 Hb 濃度依賴，藥物釋放率可達到 85%。為了進一步考察藥物釋放的可控性，將 Hb 溶液間歇性地注入 DNA 水凝膠中，結果表明加入 Hb 后藥物釋放率增加而取出 Hb 后藥物釋放率顯著降低。
圖4.體外Hb響應性藥物按需釋放的DNA水凝膠
5. DNA 水凝膠神經細胞體外保護的研究
通過 Trans-well 建立鐵超載模型，通過測定經 DNA 水凝膠處理后細胞內鐵的含量、谷胱甘肽過氧化物酶 4（Glutathione peroxidase 4, GPX4）的表達以及脂質氧化情況。FerroOrange 染色和流式結果證明 DNA 水凝膠降低了細胞內過量的鐵，蛋白質免疫印跡法（Western blotting, WB）實驗證明了 DNA 水凝膠可以逆轉鐵死亡通路中 GPX4 的下調，此外活性氧（Reactive oxygen species, ROS）和丙二醛（Malondialdehyde, MDA）實驗證明 DNA 水凝膠可以明顯降低脂質氧化水平，表明 DNA 水凝膠可以抑制鐵死亡。最后，考察 DNA 水凝膠可以實現對 DFO 的按需釋放而不破壞正常細胞內鐵濃度，通過測定神經細胞活力證明經 DNA 水凝膠有明顯的神經保護效果。
圖5. 體外通過對抗鐵死亡和Hb毒性的DNA水凝膠的保護效果
6. DNA 水凝膠的體內生物安全性評價
為了考察水凝膠在體內的生物相容性，以正常小鼠和膠原酶誘導的 ICH 模型為研究對象，考察了 DNA 水凝膠在體內的穩定性和特異性，結果證明了 DNA 水凝膠和未響應 DNA 水凝膠在正常的小鼠體內可保持 7 天穩定。在 ICH 模型，觀察到 DNA 水凝膠在第 2 天逐步溶膠，在第 6 天基本完全溶解，而未響應 DNA 水凝膠在一周內基本穩定，表明 DNA 水凝膠在 ICH 可以發生特異性溶膠。此外，以生理鹽水為對照，將 DNA 水凝膠注入正常小鼠內，通過酶聯免疫實驗（Enzyme-linked immunosorbent assays， ELISA）考察了小鼠腦部炎癥因子的變化，結果表明，DNA 水凝膠并沒有引起明顯的炎癥反應，進一步通過蘇木素-伊紅染色（Hematoxylin and eosin stain，H&E） 和原位末端轉移酶標記染色（Transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling assay, TUNEL），證明了 DNA 水凝膠在小鼠體內具有良好的生物相容性。
圖6. 體內水凝膠的穩定性、特異性和生物安全性
7.DNA 水凝膠的體內藥效學評價
進一步考察了 DNA 水凝膠的體內治療效果，首先以膠原酶誘導的 ICH 模型為基礎，通過普魯士藍染色和 GPX4 的 免疫熒光染色證明了小鼠腦部的鐵沉積明顯降低且 DNA水凝膠逆轉了再出血后 GPX4 的下調，后續通過 ROS 免疫熒光染色和 MDA 實驗，證明了 DNA 水凝膠 顯著降低了小鼠腦部的脂質氧化水平。此外，血腫的吸收與鐵死亡有密切的關系，經DNA 水凝膠治療后小鼠腦部血腫從 17%降至 4%，隨后測定了小鼠腦部 Hb 的含量，結果證明趨勢同血腫一樣，Hb 濃度也明顯降低。術后行為學恢復對治療干預的有效性至關重要，通過考察 DNA 水凝膠治療后第 1 天、第 2 天、第 3 天 和第 7 天的行為學恢復，結果也證明了 DNA 水凝膠組在術后恢復效果明顯。
圖7. 體內水凝膠治療效果
圖8. 體內腦出血小鼠模型的術后康復
8.DNA 水凝膠體內治療和診斷的研究
基于核酸的可編程性，對 DNA 水凝膠核酸骨架進行標記熒光，通過 Cy3 標記 Hb 適配體，BHQ2 標記 S-B 鏈來重新編輯 DNA 序列，以實現自診斷。首先以膠原酶誘導再出血模型，考察 DNA 水凝膠在體內的熒光變化，以健康小鼠為對照，結果證明再出血模型組的熒光強度明顯增加。為進一步考察體內的再診斷效果，建立自體血模型，將熒光標記的 DNA 水凝膠注入不同體積的再出血模型中觀察熒光的變化，同時采用核磁共振（Magnetic resonance imaging, MRI）驗證了小鼠腦部不同體積的出血量下，熒光強度的變化，表明 DNA 水凝膠的可依據于出血量的變化而給出相應提示。為了考察 DNA 水凝膠的自治療效果，以自體血模型為實驗對象，考察了再出血量和 Hb 變化，結果證明 DNA 水凝膠可明顯降低再出血量并顯著提高模型組的神經功能恢復。DNA 水凝膠提高了 ICH 術后再出血的治療效果，為術后再出血的治療提供了新的思路。
圖9. 術后再出血的自我診斷和自我治療DNA水凝膠
本文構建了用于腦出血術后再出血治療的原位植入 Hb 響應 DNA 水凝膠。該 DNA 水凝膠能夠特異性捕獲毒性 Hb 并診斷再出血的發生。此外，Hb的捕獲會觸發 DNA 水凝膠從凝膠到溶膠的轉變，特異性地釋放 DFO，進而避免破壞生理性鐵依賴功能。按需釋放的 DFO 可通過抑制神經細胞的鐵死亡來達到再出血的治療。DNA 水凝膠的應用有望解決 ICH 患者術后再出血問題，同時，DNA 水凝膠為其他腦部手術治療也提供新的思路。對這一方向的深入研究和實際應用可為各種腦部疾病的術后治療提供更有效、更安全的方法，也會推動患者的康復和提高患者生存率。
原文鏈接：
In situ implantable DNA hydrogel for diagnosis and therapy of postoperative rehemorrhage following intracerebral hemorrhage surgery Wenyan Yu, Enpeng Gong, Changlin Wang, Chengyuan Che, Yuzhen Zhao, Xinyun Wu, Yi Yang, Haiyu Shi, Mengjuan Chen, Mingge Li, Li Xie, Yue Guo, Mingming Guo, Liya Mu, Zhenya Wang, Zhenzhong Zhang, Kaixiang Zhang, Junjie Liu, and Jinjin Shi
https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.ado3919
