中山大學(xué)王山峰教授團(tuán)隊(duì) AHM：系統(tǒng)揭示高分子力學(xué)性能在調(diào)控體外干細(xì)胞命運(yùn)和體內(nèi)軟、硬組織再生方面的一致性和傾向性
基底模量已被廣泛認(rèn)可是影響細(xì)胞行為和功能的關(guān)鍵因素之一。例如，低模量基底促進(jìn)神經(jīng)突延伸，而抑制神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞遷移和增殖。人源間充質(zhì)干細(xì)胞（hMSCs）可在與相應(yīng)組織模量相似的基底上分別分化為神經(jīng)元、成肌細(xì)胞和成骨細(xì)胞（彈性模量E為0.1-40 kPa）。多種因素尤其是模量的有效解耦對(duì)于厘清不同材料表面性質(zhì)對(duì)細(xì)胞行為的影響至關(guān)重要。目前關(guān)于基底模量對(duì)于體外細(xì)胞行為影響的眾多結(jié)果尚未系統(tǒng)地與具有更復(fù)雜的生物力學(xué)、化學(xué)和拓?fù)涮卣鞯捏w內(nèi)真實(shí)微環(huán)境相關(guān)聯(lián)。尤其是，在對(duì)于模量迥異的硬、軟兩種類型的組織進(jìn)行修復(fù)，在材料的力學(xué)需求上是否具有傾向性，是組織工程和生物材料領(lǐng)域的重要問(wèn)題。
近日，中山大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院王山峰教授團(tuán)隊(duì)為全面、系統(tǒng)地回答這個(gè)問(wèn)題，以“Opposite Mechanical Preference of Bone/Nerve Regeneration in 3D-printed Bioelastomeric Scaffolds/Conduits Consistently Correlated with YAP-Mediated Stem Cell Osteo/Neuro-genesis”為題發(fā)表在《Advanced Healthcare Materials》上（DOI：10.1002/adhm.202301158）。文章第一作者為中山大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院2019級(jí)博士畢業(yè)生成肖鵬，主通訊作者為其導(dǎo)師王山峰教授。相關(guān)成果該研究得到國(guó)家自然科學(xué)基金（51973242和81602205）和中山大學(xué)“百人計(jì)劃”啟動(dòng)經(jīng)費(fèi)的支持。在這項(xiàng)工作中，作者首先制備了一種新型可光固化非晶型聚合物：聚三亞甲基碳酸酯富馬酸酯（PTMCF，中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)?zhí)枺?/span>202011000150.4），通過(guò)調(diào)控前驅(qū)體分子量可有效調(diào)控交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)的力學(xué)性能，而不改變其表面性能包括浸潤(rùn)性和蛋白吸附能力。該聚合物可通過(guò)模具法和面投影微立體光刻技術(shù)（PμSL）分別制備具有單因素變量（模量）的二維基底和三維支架，并分別用于研究模量對(duì)體外人源間充質(zhì)干細(xì)胞行為以及體內(nèi)軟硬組織再生的影響（圖1）。
圖1. 生物可降解彈性體調(diào)節(jié)hMSCs的命運(yùn)和體內(nèi)骨/神經(jīng)組織再生。
通過(guò)改變前驅(qū)體分子量（500、1000和2000 g/mol：0.5k、1k和2k）可有效調(diào)控交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)力學(xué)性能（圖2a,b），PTMCF0.5k、1k和2k的拉伸模量（E）分別為：990 ± 80 kPa、680 ± 130 kPa和90 ± 11 kPa。在PBS中模擬降解長(zhǎng)達(dá)兩年后，PTMCF0.5k、1k和2k的殘余質(zhì)量比分別為44 ± 9%、59 ± 7%和66 ± 13%（圖2c）。此外，PTMCF網(wǎng)絡(luò)具有簡(jiǎn)易合成、透明、可打印性、可生物降解性、優(yōu)異的E和斷裂伸長(zhǎng)率（εbreak）等特點(diǎn)，總體上優(yōu)于大多數(shù)已報(bào)道的彈性體（圖2d）。圖2e為眾多彈性體的E與εbreak的Ashby圖，以比較PTMCF彈性體與現(xiàn)有報(bào)道的光固化打印生物可降解彈性體和用于細(xì)胞力學(xué)信號(hào)傳導(dǎo)的彈性體。這里可以看到PTMCF彈性體的εbreak可以達(dá)到550%，在兩對(duì)比組中優(yōu)于大多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道的彈性體，且PTMCF的E位于常用于調(diào)節(jié)干細(xì)胞命運(yùn)的模量范圍內(nèi)。
圖2a. PTMCF生物彈性體的力學(xué)性能：（a）應(yīng)力應(yīng)變曲線和（b）拉伸與剪切性能統(tǒng)計(jì)；（c）37 °C 下PTMCF網(wǎng)絡(luò)在PBS中的降解曲線。（d）PTMCFs與典型生物彈性體在簡(jiǎn)易合成、透明度、生物降解性、拉伸模量、斷裂伸長(zhǎng)率和歸一化可打印性的比較。（b）PTMCF、立體光刻打印生物降解彈性體和細(xì)胞力學(xué)傳導(dǎo)彈性體的εbreak和E的Ashby圖。
PTMCF0.5k與2k中較高密度的碳碳雙鍵可以保證打印的流暢性。此外，由于PTMCF0.5k的超低粘度，其樹(shù)脂中的聚合物成分可高達(dá)90%。優(yōu)化聚合物樹(shù)脂配方以及打印參數(shù)后采用PμSL打印了高分辨率的三維gyroid骨修復(fù)支架結(jié)構(gòu)、單通道神經(jīng)導(dǎo)管和血管網(wǎng)絡(luò)（圖3a），而且PTMCF神經(jīng)導(dǎo)管具有較高的柔韌性，可以抵抗彎曲、扭轉(zhuǎn)等變形而不被破壞且可回復(fù)至最初形狀（圖3b）。更重要的是，用于體內(nèi)股骨和坐骨神經(jīng)修復(fù)的支架和導(dǎo)管具有相似的三維微結(jié)構(gòu)和不同的力學(xué)性能：PTMCF0.5k和2k骨支架的壓縮模量分別為580 ± 90和85 ± 13 kPa，PTMCF0.5k和2k神經(jīng)導(dǎo)管的法向剛度分別為8.5 ± 1.4和1.6 ± 0.3 N/mm。
圖3. Gyroid支架、單通道神經(jīng)導(dǎo)管和血管網(wǎng)絡(luò)支架（從左至右）模型圖以及相應(yīng)的實(shí)物SEM圖。（b）PTMCF2k神經(jīng)導(dǎo)管的柔韌性展示。（c）PTMCF0.5k和2k的gyroid支架的壓應(yīng)力應(yīng)變曲線，（d）神經(jīng)導(dǎo)管徑向壓縮力-位移曲線。
當(dāng)模量處于90-990 kPa范圍內(nèi)，hMSCs粘附、增殖與模量（剛度）呈正相關(guān)。細(xì)胞粘著斑蛋白（FAs）是細(xì)胞感應(yīng)外界機(jī)械力的中心樞紐，亦是整合素-細(xì)胞外基質(zhì)連接細(xì)胞骨架的橋梁。圖4a結(jié)果表明高模量基底上的hMSCs通過(guò)募集更多的FAs從而進(jìn)行細(xì)胞鋪展。整合素-FAs已被發(fā)現(xiàn)可介導(dǎo)Hippo通路并與Yes-associated protein（YAP）產(chǎn)生相互作用。這里作者發(fā)現(xiàn)YAP對(duì)于FAs的形成以及細(xì)胞鋪展至關(guān)重要（圖4a）。相較抑制YAP的轉(zhuǎn)錄活性，在無(wú)YAP抑制條件下的hMSCs表現(xiàn)出模量依賴性，模量介導(dǎo)YAP轉(zhuǎn)錄活性（圖4b,c）。通過(guò)基因和蛋白表明發(fā)現(xiàn)在模量位于90-990 kPa范圍內(nèi)，較硬基底可顯著促進(jìn)hMSCs成骨分化，較軟基底可促進(jìn)hMSCs成神經(jīng)分化，且YAP轉(zhuǎn)錄活性是驅(qū)動(dòng)hMSCs分化的關(guān)鍵（圖4d）。
圖4. （a）使用或不使用YAP抑制劑verteporfin在PTMCF基底上培養(yǎng)hMSCs 一天后的三重免疫熒光染色。（b）hMSCs在PTMCF不同模量基底上培養(yǎng)1d的細(xì)胞響應(yīng)機(jī)制。（c）定量分析不同PTMCF基底上hMSCs的YAP核質(zhì)比。（d）qRT-PCR分析PTMCF基底上培養(yǎng)不同時(shí)間的hMSCs成骨相關(guān)基因和成神經(jīng)元相關(guān)基因表達(dá)。
將3D打印支架植入SD大鼠股骨髁缺損模型，8周后進(jìn)行觀察（圖5a）。植入的gyroid支架可為體內(nèi)的細(xì)胞增殖、遷移和分化提供適宜的生理環(huán)境。結(jié)果表明高模量支架可顯著促進(jìn)大鼠股骨修復(fù)（圖5b）。將3D打印導(dǎo)管植入SD大鼠坐骨神經(jīng)缺損模型，在修復(fù)過(guò)程中進(jìn)行電生理測(cè)試，并在12周后進(jìn)行組織切片染色觀察等（圖5c），結(jié)果表明適宜的低基質(zhì)模量可以加速雪旺細(xì)胞的的遷移增殖，促進(jìn)賓格內(nèi)氏帶（Bungner''s bands）的形成，進(jìn)而促進(jìn)新的神經(jīng)纖維和髓鞘形成。基質(zhì)模量可以影響大鼠周圍神經(jīng)恢復(fù)，且適宜的低模量可以促進(jìn)其恢復(fù)，顯示出與骨組織修復(fù)相反的趨勢(shì)。
圖5. （a）3D打印支架用于體內(nèi)股骨修復(fù)以及（b）8周后修復(fù)樣本的計(jì)算機(jī)斷層掃描三維重構(gòu)圖片。（c）3D打印導(dǎo)管用于體內(nèi)坐骨神經(jīng)修復(fù)以及（d）12周后修復(fù)樣本截面的組織切片然和和透射電鏡圖。
通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)得到的模量介導(dǎo)周圍神經(jīng)修復(fù)潛在機(jī)制：適宜的模量可促進(jìn)細(xì)胞整合素表達(dá)，激活FAK磷酸化并進(jìn)一步活化Rho家族蛋白，從而激活下游蛋白以形成Arp2/3復(fù)合物，促進(jìn)肌動(dòng)蛋白成核與聚合，并形成絲狀偽足、微突起和板狀偽足，促進(jìn)神經(jīng)元生長(zhǎng)并進(jìn)一步修復(fù)周圍神經(jīng)（圖6）。上述結(jié)果揭示了在低于1 MPa基底或支架模量上體外hMSCs響應(yīng)和體內(nèi)骨與神經(jīng)組織修復(fù)的影響趨勢(shì)。作者特別選擇了更有爭(zhēng)議的周圍神經(jīng)作為代表使用RNA測(cè)序在轉(zhuǎn)錄組水平上探索基底模量介導(dǎo)周圍神經(jīng)的潛在機(jī)制。對(duì)于特定的細(xì)胞和組織為什么會(huì)存在一個(gè)最佳的模量范圍，以及在組織修復(fù)過(guò)程中，最佳模量范圍的基底在體內(nèi)微環(huán)境中是如何促進(jìn)組織修復(fù)的，這是組織工程領(lǐng)域中的關(guān)鍵但目前尚未完全闡釋清楚的科學(xué)問(wèn)題。未來(lái)需要完成更全面和更深入的實(shí)驗(yàn)，如制備更寬范圍的模量基底與支架以及多組學(xué)數(shù)據(jù)間的關(guān)聯(lián)從而探尋上述的最佳模量范圍以及深入研究模量介導(dǎo)的骨和周圍神經(jīng)修復(fù)的作用機(jī)制。
圖6. 模量介導(dǎo)周圍神經(jīng)再生的潛在機(jī)制示意圖。
原文鏈接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adhm.202301158
