writer：章培標(biāo), 侯宜, 武漢,周余來, 賈曉晶, 龔守良, 顏煒群，侯立中
keywords：內(nèi)皮生長因子/生物合成; 細(xì)胞; 培養(yǎng)的; 基因; 轉(zhuǎn)染; 成纖維細(xì)胞; 人工皮膚 ;
source：期刊
specific source：中國臨床康復(fù), 2006, 10(13):87-89
Issue time：2006年
［摘要］觀察外源性人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子基因?qū)胝Ｕ嫫こ衫w維細(xì)胞后,能否表達(dá)及分泌血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子,為進(jìn)一步構(gòu)建轉(zhuǎn)VEGF165基因組織工程皮膚在創(chuàng)傷修復(fù)中的應(yīng)用提供新移植物.方法:實(shí)驗(yàn)于2001-06/2005-06在長春吉林大學(xué)完成.①真核表達(dá)載體pcDNA3.0-hVEGF165的擴(kuò)增、純化和鑒定過程為大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞的制備→pcDNA3.0-hVEGF165質(zhì)粒DNA細(xì)菌轉(zhuǎn)化→pcDNA3.0-hVEGF165質(zhì)粒大量制備(堿裂解法)→質(zhì)粒純化→質(zhì)粒含量純度測定.提取的質(zhì)粒載體用EcoRⅠ和XbaⅠ雙酶切,瓊脂糖凝膠電泳鑒定.②選取清潔級(jí)新生日本大耳白兔2只,無菌條件下取新生兔皮膚,盡量去除皮下組織,切成寬0.3 cm小條塊,Ⅰ型膠原酶消化,進(jìn)行真皮成纖維細(xì)胞的分離與培養(yǎng).脂質(zhì)體介導(dǎo)真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.0-hVEGF165轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的兔皮膚成纖維細(xì)胞,經(jīng)G418篩選,獲得陽性轉(zhuǎn)染細(xì)胞克隆,并進(jìn)行傳代擴(kuò)增.③酶聯(lián)免疫吸附法檢測轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間段的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子蛋白表達(dá)水平;原位雜交顯示轉(zhuǎn)基因細(xì)胞內(nèi)VEGF165mRNA的表達(dá)情況;流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期和凋亡情況;透射電子顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染后真皮成纖維細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu).結(jié)果:①質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果:提取的質(zhì)粒經(jīng)雙酶切、瓊脂糖凝膠電泳鑒定后可得到5.4kb和0.57kb兩個(gè)片段,與原質(zhì)粒圖譜符合,表明所提取的質(zhì)粒為重組質(zhì)粒pcDNA3.0-VEGF165.②pcDNA3-hVEGF165基因轉(zhuǎn)染真皮成纖維細(xì)胞情況:共進(jìn)行15次轉(zhuǎn)染試驗(yàn),35孔(皿)均有G418抗性集落形成,表明pcDNA3.0-hVEGF165經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)可有效轉(zhuǎn)染正常皮膚成纖維細(xì)胞.③血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子蛋白的表達(dá):pcDNA3.0-hVEGF165轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞后,24 h即有較高水平的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子蛋白表達(dá),高達(dá)(3 280±2 054)ng/L,并于48,72 h呈下降趨勢.④血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子cDNA原位雜交檢測結(jié)果:轉(zhuǎn)染后成纖維細(xì)胞可見散在的陽性細(xì)胞表達(dá)hVEGF mRNA.G418應(yīng)用2～4周后,可成功篩選出轉(zhuǎn)基因成纖維細(xì)胞克隆,篩選后可見大量陽性的轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)hVEGF mRNA.⑤成纖維細(xì)胞的細(xì)胞周期分布及凋亡檢測:轉(zhuǎn)染后成纖維細(xì)胞S期細(xì)胞比例增加,G1和G2期細(xì)胞減少,表明細(xì)胞DNA的合成以及細(xì)胞的增殖活動(dòng)加強(qiáng).但細(xì)胞凋亡率逐漸升高,轉(zhuǎn)染前為1.26%,轉(zhuǎn)染后2 d為2.64%,至12代時(shí)高達(dá)17.35%.⑥轉(zhuǎn)染后成纖維細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察:細(xì)胞表面有較多微絨毛,核呈不規(guī)則形,胞質(zhì)內(nèi)可見較多的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體,沿膜可見一些膜包被顆粒.結(jié)論:真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.0-hVEGF165成功導(dǎo)入家兔皮膚成纖維細(xì)胞,在短時(shí)期內(nèi)可高水平地表達(dá)分泌血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子,在治療缺血性疾病和促進(jìn)創(chuàng)傷修復(fù)及以其作為種子細(xì)胞構(gòu)建轉(zhuǎn)基因組織工程皮膚治療皮膚缺損等方面顯示出較好的應(yīng)用前景.
http://d.wanfangdata.com.cn/Periodical_xdkf200613032.aspx