作者：章培標, 侯宜, 武漢,周余來, 賈曉晶, 龔守良, 顏煒群，侯立中
關(guān)鍵字：內(nèi)皮生長因子/生物合成; 細胞; 培養(yǎng)的; 基因; 轉(zhuǎn)染; 成纖維細胞; 人工皮膚 ;
論文來源：期刊
具體來源：中國臨床康復(fù), 2006, 10(13):87-89
發(fā)表時間：2006年
［摘要］觀察外源性人血管內(nèi)皮細胞生長因子基因?qū)胝Ｕ嫫こ衫w維細胞后,能否表達及分泌血管內(nèi)皮細胞生長因子,為進一步構(gòu)建轉(zhuǎn)VEGF165基因組織工程皮膚在創(chuàng)傷修復(fù)中的應(yīng)用提供新移植物.方法:實驗于2001-06/2005-06在長春吉林大學完成.①真核表達載體pcDNA3.0-hVEGF165的擴增、純化和鑒定過程為大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞的制備→pcDNA3.0-hVEGF165質(zhì)粒DNA細菌轉(zhuǎn)化→pcDNA3.0-hVEGF165質(zhì)粒大量制備(堿裂解法)→質(zhì)粒純化→質(zhì)粒含量純度測定.提取的質(zhì)粒載體用EcoRⅠ和XbaⅠ雙酶切,瓊脂糖凝膠電泳鑒定.②選取清潔級新生日本大耳白兔2只,無菌條件下取新生兔皮膚,盡量去除皮下組織,切成寬0.3 cm小條塊,Ⅰ型膠原酶消化,進行真皮成纖維細胞的分離與培養(yǎng).脂質(zhì)體介導(dǎo)真核表達質(zhì)粒pcDNA3.0-hVEGF165轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的兔皮膚成纖維細胞,經(jīng)G418篩選,獲得陽性轉(zhuǎn)染細胞克隆,并進行傳代擴增.③酶聯(lián)免疫吸附法檢測轉(zhuǎn)染后不同時間段的血管內(nèi)皮細胞生長因子蛋白表達水平;原位雜交顯示轉(zhuǎn)基因細胞內(nèi)VEGF165mRNA的表達情況;流式細胞儀檢測細胞周期和凋亡情況;透射電子顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染后真皮成纖維細胞的超微結(jié)構(gòu).結(jié)果:①質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果:提取的質(zhì)粒經(jīng)雙酶切、瓊脂糖凝膠電泳鑒定后可得到5.4kb和0.57kb兩個片段,與原質(zhì)粒圖譜符合,表明所提取的質(zhì)粒為重組質(zhì)粒pcDNA3.0-VEGF165.②pcDNA3-hVEGF165基因轉(zhuǎn)染真皮成纖維細胞情況:共進行15次轉(zhuǎn)染試驗,35孔(皿)均有G418抗性集落形成,表明pcDNA3.0-hVEGF165經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)可有效轉(zhuǎn)染正常皮膚成纖維細胞.③血管內(nèi)皮細胞生長因子蛋白的表達:pcDNA3.0-hVEGF165轉(zhuǎn)染成纖維細胞后,24 h即有較高水平的血管內(nèi)皮細胞生長因子蛋白表達,高達(3 280±2 054)ng/L,并于48,72 h呈下降趨勢.④血管內(nèi)皮細胞生長因子cDNA原位雜交檢測結(jié)果:轉(zhuǎn)染后成纖維細胞可見散在的陽性細胞表達hVEGF mRNA.G418應(yīng)用2～4周后,可成功篩選出轉(zhuǎn)基因成纖維細胞克隆,篩選后可見大量陽性的轉(zhuǎn)染細胞表達hVEGF mRNA.⑤成纖維細胞的細胞周期分布及凋亡檢測:轉(zhuǎn)染后成纖維細胞S期細胞比例增加,G1和G2期細胞減少,表明細胞DNA的合成以及細胞的增殖活動加強.但細胞凋亡率逐漸升高,轉(zhuǎn)染前為1.26%,轉(zhuǎn)染后2 d為2.64%,至12代時高達17.35%.⑥轉(zhuǎn)染后成纖維細胞超微結(jié)構(gòu)觀察:細胞表面有較多微絨毛,核呈不規(guī)則形,胞質(zhì)內(nèi)可見較多的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體,沿膜可見一些膜包被顆粒.結(jié)論:真核表達質(zhì)粒pcDNA3.0-hVEGF165成功導(dǎo)入家兔皮膚成纖維細胞,在短時期內(nèi)可高水平地表達分泌血管內(nèi)皮細胞生長因子,在治療缺血性疾病和促進創(chuàng)傷修復(fù)及以其作為種子細胞構(gòu)建轉(zhuǎn)基因組織工程皮膚治療皮膚缺損等方面顯示出較好的應(yīng)用前景.
http://d.wanfangdata.com.cn/Periodical_xdkf200613032.aspx