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吳晨，潘繼倫，包志明，俞耀庭(南開大學分子生物學研究所生物活性材料教育部重點實驗室, 天津300071)Studies on porous chitosan microcarriersWU Chen, PAN Ji-lun, BAO Zhi-ming, YU Yao-ting(The Key Laboratory of Bioactive Materials, Ministry of Education, Nankai University, Tianjin 300071, China)
Abstract：Using chitosan as raw materials, a suitable size (300~500µm)microcarriers were prepared by suspension method, using glutaraldehyde as crosslinker, which have an average pore size of 50~70µm, density of 1.04g/ml and porosity above 86%. The microcarriers were then modified with lactose and the reacted lactose can reached to 42.6mg/g microcarriers. Rat hepatocytes were cultured on modified chitosan porous microcarriers and retained spherical shape which was similar to those in vivo and formed aggregates on the microcarriers. In conclusion, modified porous chitosan microcarriers have a promising future in the study of the hybrid bioartificial liver support system.Key words：chitosan；microcarriers；hepatocyte摘要：利用液體石蠟作分散介質，戊二醛作交聯劑，制備出粒徑為300～500µm，孔徑50～70µm，孔隙率86％的大孔殼聚糖微載體，并以乳糖對微載體進行了糖基化修飾，在優化條件下其接糖量可達到42.6mg/g載體。用原代大鼠肝細胞進行材料的細胞相容性研究，結果顯示乳糖修飾的殼聚糖大孔微載體具有良好的細胞相容性。關鍵詞：殼聚糖；微載體；肝細胞中圖分類號：O636.1；R967.4 文獻標識碼：A文章編號：1001-9731（2004）增刊-2451-031 引言 人工肝支持系統（bioartificial liver support system，BAL）是近年來發展起來為肝衰竭患者提供體外肝功能支持的裝置，其核心部分細胞反應器由載體材料和肝細胞兩部分組成，前者為細胞提供生長、代謝場所，后者為BAL提供特異性代謝功能。人工肝支持系統內肝細胞的數量和功能是能否有效替代已衰竭肝臟功能的關鍵[1,2]。大孔微載體高的比表面積與高的孔隙率適合于在有限的培養體積內黏附培養大量的肝細胞。殼聚糖與細胞外基質中的糖胺聚糖的分子結構相似，殼聚糖作為材料制成微載體，其細胞親和性好，是一種制造細胞培養用微載體的良好材料[3,4]。本文用反相懸浮法和相分離法相結合，制備了微米級大孔殼聚糖微載體，提高了材料的孔隙率和比表面積，并以肝細胞表面無唾液酸糖蛋白受體(asialoglycoprotein receptor，ASGPR)的特異性配體作糖基化修飾以利于細胞在材料表面的粘附。通過在微載體上培養大鼠原代肝細胞，證明乳糖修飾的大孔殼聚糖微載體是較理想的肝組織工程支架材料。2 材料和方法2.1 材料 殼聚糖，脫乙酰度90%，分子量120萬，浙江省海洋生物化學有限公司；乳糖，A.R.，天津市化學試劑六廠；Wistar大鼠，200～250g，天津市軍事醫學科學研究院提供；Trypan Blue，上海化學試劑采購供應站；膠原酶IV，Sigma Chemical Co.Ltd；HEPES，北京鼎國生物技術發展中心；新生牛血清，聯星生物技術有限公司；慶大霉素，天津金耀氨基酸有限公司2.2 大孔殼聚糖微載體的制備 取一定量液體石蠟、四氯化碳和適量span80，混合均勻后加入到三口瓶中，然后按一定油水比例加入適量2.5%殼聚糖乙酸溶液，以適當的攪拌速度在25℃下充分攪拌至殼聚糖溶膠均勻分散成合適大小液滴后，加入一定體積8%戊二醛溶液，攪拌30min后逐漸升溫至40℃，恒溫反應2h，經過過濾、充分洗滌后，再經過-30℃冷凍干燥，得到殼聚糖大孔微載體。 將得到的殼聚糖大孔微載體加到濃度為30mol/dm3的乙酸鈉溶液中，按照硼氫化鈉對初始氨基總和的摩爾比率為3：1加入硼氫化鈉，室溫反應12h，用蒸餾水洗至中性。2.3 大孔殼聚糖微載體的糖基化修飾 取1g吸干的微載體，加入2mL一定濃度的NaOH溶液，混勻后，加入適量環氧氯丙烷，于一定溫度下搖床上振蕩反應。反應完成后裝柱，用蒸餾水淋洗微載體，洗出液用含有酚酞指示劑的1.3 mol/dm3的硫代硫酸鈉溶液檢測，至洗出液不變紅，證明剩余環氧氯丙烷已洗凈。取1g抽干的微載體加入到4mL不同pH值的乳糖反應體系（糖初始濃度均為35mg/mL）中，在一定溫度下反應。反應結束后取出微載體，用蒸餾水洗至中性。2.4 大孔殼聚糖微載體孔隙率的測定[5] 孔隙率的測定使用Shen F等提出的方法。通過冷干前后支架重量的變化推算出孔隙率的大小。2.5 糖基化反應程度的測定[6] 用3,5－二硝基水楊酸比色法（DNS法）測定反應前后乳糖濃度的變化，根據乳糖的消耗量計算出殼聚糖支架氨基的修飾程度。2.6 原代大鼠肝細胞的分離和培養 采用Seglen兩步灌流法[7~11]，從重量為200～250ｇ的Wistar大鼠獲得原代肝細胞。先用預灌流液(83mg/mLNaCl，0.5mg/mL KCl，24mg/mL，HEPES，pH=7.4)灌流8min，然后用含0.05%膠原酶的灌流液(預灌流液中加入5mmol/LCaCl2, 0.05%膠原酶)繼續灌流10min。將肝葉剪下，用剪刀將消化好的肝細胞輕輕刮下，獲得的肝細胞懸液400r/min離心3次，每次2min，然后重新懸浮于WE培養基中(含10%血清，0.2u/mL Insulin，0.292mg/mL Glutamine)。利用苔盼藍拒染法檢測細胞存活率。將分離所得的肝細胞按1×106細胞/mL的密度接3 結果和討論3.1 糖基化條件的優化 由圖1可以看出，環氧化后的微載體在偏酸性或偏堿性的條件下均可以達到接糖量較大的目的，原因在于環氧基團在酸、堿條件下均可以開環反應，但相比而言，偏酸性條件下的接糖量較高，原因是羥基是較弱的親核試劑，當環氧氯丙烷在酸性條件下才能開環和羥基反應。當pH=4.5時接糖量大，因此乳糖的最佳接糖條件為pH=4.5。
從圖2可以看出，當反應達到12h時接糖量幾乎達到最大值，繼續延長反應時間，其接糖量變化不是很明顯，因此我們選擇乳糖的反應時間為12h。其最大接糖量為42.6mg/g微載體。
3.2 紅外光譜分析 圖3中的CS-1中1599cm-1處的峰為殼聚糖上氨基的特征峰，在交聯殼聚糖的譜圖CS-2中氨基特征峰變弱，這是因為和戊二醛反應的結果，并且在1633.3cm-1和1496.4cm-1處出現C=N伸縮振動特征峰，說明殼聚糖發生交聯反應有希夫堿的形成，CS-3中這兩個特征峰的消失說明已將希夫堿充分還原，CS-4中在810cm-1和880cm-1 處有環氧基團吸收峰出現，說明已經發生環氧化反應。
3.3 電鏡觀察 從圖4看到用2.5%的殼聚糖溶液制得的大孔微載體粒徑為300～500µm，孔徑40～70µm，粒徑分布較均勻，形態規整，經測定其孔隙率為86%。 圖5是乳糖修飾后微載體上細胞培養的情況，由圖可見，乳糖修飾后的微載體上肝細胞密度高，肝細胞形成聚集體，保持良好的球形，表面有很多微絨毛結構，表明肝細胞處于良好的生理狀態。聚集體內部細胞緊密接觸，形成類組織結構。
4 結論 用反相懸浮法結合相分離法制備了微米級大孔殼聚糖微載體，并用乳糖進行修飾，確定了反應pH和反應時間的最佳條件，其接糖量達到42.6mg/g載體。修飾微載體用于原代大鼠肝細胞培養，實驗結果表明，乳糖修飾殼聚糖大孔微載體具有良好的細胞相容性。參考文獻：[1] Hayes, Peter C, Lee Alistair. [J]. The Lancet, 2001, 358 (9290): 1286-1287[2] Kaneko M, Fukuda J, Ijima H, et al. [J]. Materials Science and Engineering: C, 1998, 6(4): 245-248.[3] Hirano S. [J]. Polym Mater Sci Eng,1990, 63:699.[4] Yagi K, Michibayashi N, Kurikawa N, et al. [J]. Biol, Pharm, Bull, 1997,20(12):1290-1294.[5] Shen F, Cui Y L, Yang L F, et al. [J]. Polym Int, 2000, 49: 1596-1599.[6] Ruliang Li. Biochemistry Experiments. [M]. Wuhan: Wuhan Univer- sity Press, 1998, 9-11.[7] Seglen P O. [J]. Exp Cell Res, 1972; 74: 450-454.[8] Seglen P O. [J]. Methods Cell Biol, 1976; 13: 29-83.[9] Helmut Segner. [J]. Comp Bioc and Phy Part A, 1998, 120: 71-81.[10] Puviani A C, Ottolenghi C, Tassinari B. et al. [J]. Comp Bioc and Phy Part A, 1998, 120: 99-109.[11] Carol J, Maslansky, Gary M Williams. [J]. In Vitro, 1982, 18(8): 683-692.基金項目：天津市自然科學基金資助項目（033608011）作者簡介：吳晨（1979－），女，天津人，碩士研究生，主要研究生物工程，生物醫用材料論文來源：中國功能材料及其應用學術會議,2004年,9月12-16日 |
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